现代月季6个表型性状和SSR标记的关联分析

周俐宏，王金刚，王志刚，张 兴，龚束芳，樊金萍，车代弟

（1．辽宁省农业科学院花卉研究所，辽宁沈阳 110161； 2东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨150030； 3．黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨 163000）

现代月季6个表型性状和SSR标记的关联分析

周俐宏1，王金刚2，王志刚1，张 兴3，龚束芳2，樊金萍2，车代弟2

（1．辽宁省农业科学院花卉研究所，辽宁沈阳 110161； 2东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨150030； 3．黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨 163000）

对80个现代月季品种进行标记和复杂数量性状之间的关联分析，分析的6个表型性状包括香味、叶绒光、叶质、叶长、叶宽和花径。利用SPSS软件统计分析了每对性状间的相关性，其中，叶质和叶宽（R＝－0．370，P＜0．01）、叶长和叶宽（R＝0．917，P＜0．01）、叶宽和花径（R＝0．561，P＜0．01）、叶长和花径（R＝0．558，P＜0．01）成极显著相关；现代月季24个微卫星位点的平均等位基因数量和PIC值分别为11．42（2～31）和0．70，异质性为0～0．98，说明所选群体的遗传变异较大；用Powermarker软件分析现代月季表型性状和标记间的关联，成功的找到了与现代月季6个表型性状相关联的SSR标记。

现代月季；表型性状；SSR；关联分析

现代月季（Rose hybrida Hort．）隶属于蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）多年生木本花卉，是世界上应用最普遍的观赏植物之一。月季的生产和应用主要包括切花月季、庭院月季和盆栽月季（Honrand-Saint Oyant L．et al．，2007）。尽管月季具有巨大的经济价值，但对于月季属植物的表型性状遗传研究却知之甚少。

解决性状的遗传是探索许多问题的前提，其中一个重要的步骤是找到控制表型性状的基因在基因组所处的位置，而分子标记正是一个有效的工具。找到基因附近的标记，就可以进行标记的辅助选择育种（Kraakman A．T．W．，2005；苏成付，2014）。SSRs标记稳定性好，重复性高，共显性并广泛存在和分布于高等植物的整个基因组中（Morgante and Olivieri，1993；李桂东，2015）。SSRs位点广泛存在于月季基因组中，基因组SSR标记在月季上已经得到了应用（Esselinket al．，2003；Yanet al．，2005；Zhanget al．，2006；周青，2014；邱彤，2015），月季基因组中大约每19 Kb就有一个微卫星位点（Zhanget al．，2006），应用SSRs标记去解释标记性状关系的问题比其他类型的标记更能解决问题。

文中主要研究了现代月季6个性状（香气、叶绒光、叶质、叶长、叶宽和花径）间及6个性状和SSR标记间的关联性，找到与6个现代月季表型性状相关联的SSR标记位点，为现代月季的标记辅助选择育种提供基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料和田间试验

为了获得最大可能的遗传多样性和最小的群体样本，最终选择80个现代月季品种作为试验材料。2015年调查现代月季香气、叶绒光、叶质、叶长、叶宽和花径性状，每个品种不少于5株至少3次重复。在性状的数量化上，采用等级数量编码方法，具体参照贾元义（2005）《月季品种资源的收集、分类和评价》。

1.2 表型性状的统计分析

用SPSS软件分析现代月季6个表型性状的遗传参数和相关系数。

1.3 SSR分析

应用改良的CTAB法提取现代月季基因组DNA（Torres A Met al．，1993）。共筛选102对SSR引物，其中71对引物（引物命名参照原文献）参考S．Rajapakse（2001），Z．Yan（2005），另外，本研究根据EST数据库开发了31对EST-SSR引物（引物命名为NEA1-31）。本试验所用24对引物情况见表1。

反应体系（总体积20 μl）包括3 pmol引物，0．2 mM dNTPs，0．5U Taq酶，1×缓冲液，3 mM MgCl2和30 ngDNA。PCR反应程序为94℃2 min；94℃45 s，退火（温度见表1）30 s，72℃45 s（35个循环）和72℃延伸10 min。PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测，银染法染色（曹立成，2006），照相。

1.4 数据处理

Powermarker软件（Liu K and Muse S．，2005）计算每个SSR标记的基因多样性、等位基因频率、PIC值以及性状与标记的关联分析。

2 结果与分析

2.1 表型性状的评定

对现代月季的6个主要表型性状进行相关性分析的结果见表2，其中相关系数极显著的有：叶质与叶宽（R＝－0．370，P＜0．01）、叶长与叶宽（R＝0．917，P＜0．01）、叶宽与花径（R＝0．561，P＜0．01）、叶长与花径（R＝0．558，P＜0．01）。

表1 现代月季多态性SSR引物对性质（F，正向；R，反向）Table 1 Properties of rose polymorphic SSR primer pairs（F，forward；R，reverse）

表2 现代月季9个性状的相关性Table 2 Correlations between nine traits in modern rose

2.2 SSRs多态性

102个SSRs标记共有59个SSR位点扩增出多态性，其中36个SSRs引物来自于基因组DNA，23个SSRs引物来自于现代月季EST数据库自行设计获得。随机选择24个SSRs引物用于本研究（表1）。在所有材料中，SSR反应扩增的条带分子量一般在200～1 000 bp（图1、图2）。

24对SSR位点的等位基因数量和频率根据基因频率用Powermarker软件进行分析，结果见表3。

等位基因频率是基因杂合度、多态信息含量等多个尺度的函数。由表3可以看出，对于所选群体，24个SSRs共检测出274个等位基因，等位基因的数量从2到31，平均11．42。其中NEA16和Rw5G14等位基因最多，检测出了31个。本试验SSR位点的杂合度从0到0．98，平均0．55。其中NEA26杂合度最大为0．98。

每个标记的相关信息可以根据他的PIC值进行评估。根据Nei（1973），每个SSR的PIC值反映了基因的多样性，PIC≥0．5为高度多态，PIC≤0．3为低度多态，0．3～0．5为中度多态。根据表3可知，所有位点的平均PIC值为0．70（PIC＞0．5），为高度多态，遗传变异大，最高PIC值的SSR为NEA16和Rw5G14（0．95），说明群体内基因一致性差，变异性大，选择的潜力也大。本试验所用的24个微卫星标记多态信息含量丰富，可作为有效遗传标记用于下一步的遗传分析。

图1 引物NEA17对部分现代月季的SSR扩增结果M：DNA分子量标准DL2000Figure 1 SSR amplification results of primer NEA17 in part of modern rose

图2 引物NEA28对部分现代月季的SSR扩增结果 M：DNA分子量标准DL2000Figure 2 SSR amplification results of primer NEA28 in part of modern rose

表3 现代月季24个微卫星位点的遗传参数Table 3 Genetic parameter of 24 satellite loci in modern roses

2.3 与性状相关联的标记

从表4可以看出，与香气相关联的SSR标记有3个，分别为NEA06，NEA20和NEA25；与叶绒光相关联的分子标记有7个，分别为NEA10、NEA17、NEA22、NEA26、NEA29、Rw5G14和Rw15D15；与叶质相关联的标记有2个，分别为NEA25和Rw5G14；与叶长相关联的标记有9个，分别为NEA06，NEA10，NEA15，NEA17，NEA20，NEA21，NEA25，NEA29和Rw15D15；与叶宽相关联的标记主要有8个，分别为NEA06、NEA15，、NEA17、NEA20、 NEA21、NEA25、NEA29和Rw15D15；与花径相关联的标记有6个，分别为NEA02、NEA10、NEA17、NEA26、NEA29和Rw15D15。

综合分析发现：与现代月季6个主要表型性状相关联的位点累计有13个，其中与叶长相关联的位点最多为9个，与叶质相关联的位点最少为2个。同一位点与多个性状相关联情况很普遍，例如NEA17和Rw15D15同时与叶长、叶宽和花径相关联。这表明现代月季性状表型的相关是确有其内在遗传因素的。

表4 与现代月季6个表型性状相关联的标记Table 4 Markers correlated to nine phenotype traits in modern rose

3 结论与讨论

3.1 所选群体的遗传变异

多态信息含量的差异能够反映物种间遗传多样性的差异，是衡量现代月季基因片段多态性和变异程度较好的指标。同时多态性信息含量关系到该座位可用性及使用效率。在一个群体中，多态信息含量越大，该座位杂合子比例则越大，提供的遗传信息就越高。本研究的80个现代月季的24个位点平均多态信息含量为0．70，最高多态性信息含量为NEA16和Rw5G14（0．95），最低为NEA19（0．32）。其所有位点多态性信息含量PIC＞0．25，都达到多态水平，表明所选现代月季群体具有丰富的遗传多样性。

基因杂合度又称基因多样度，反映群体在多个基因座位上的遗传变异，一般认为它是度量遗传变异的一个最适参数。平均杂合度可以近似反映群体遗传结构变异程度的高低，杂合度越大，群体的变异越大。一个没有进行过人工选择的群体平均基因多样度越高，该群体就越接近于一个平衡的自然群体。如果某个位点的基因多样度在所有品种中都较大，说明这个位点的遗传多样性比较丰富，可能是该物种中最原始最保守的位点，就更适合做遗传关系的研究。遗传杂合度通常认为是度量群体遗传变异的最适参数，杂合度越高，群体的遗传变异就越丰富，可选择的范围就广，若群体杂合度高于0．5，表明该群体没有受到高强度的选择，拥有丰富的遗传多样性。从研究的24个多态性位点反映出的信息来看，平均遗传杂合度为0．55，说明了本实验群体遗传变异的程度较高，可做进一步选择。

有效等位基因数和多态信息含量一样，都可以用来度量群体遗传多样性。有效等位基因数是基因纯合度的倒数，它表明等位基因间所谓的相互影响。如果等位基因在群体中分布越均匀，有效等位基因越接近实际检测到的等位基因的绝对数。有效等位基因数目和实际检测到的数目是有差距的，这时因为有些基因频率相对很高，有些基因频率相对很低，基因分布不均匀。本研究中24个位点平均11．42个等位基因。强海平等（2014）用SSR标记分析中美紫花苜蓿品种遗传多样性，40对全基因组SSR标记平均每个位点等位基因数为11．2；王凤格等（2014）对328个玉米品种进行SSR分析，40对引物的平均等位基因变异为8．10；李鹤等（2014）对砧用南瓜种质资源进行SSR分析，结果表明平均每个SSR位点的等位基因数为4．18个。

3.2 标记性状的关联性分析

分子标记从分子水平上跟踪基因组中各染色体区段或位点的遗传规律，结合性状表现型的遗传规律，确定与某一性状的连锁关系，并进行QTL定位。标记性状连锁分析在概念上是根据标记位点的基因型以及性状的表型对个体进行显著性检验，差异显著则说明标记与数量性状存在关联性。在实质上是利用标记与影响性状位点之间的连锁。因此，如果一个群体的性状差异显著，就可以通过标记与性状的相关性分析，找出性状与一个或多个标记的遗传相关，从而实现从表型到基因型选择育种的转变。

在本研究中，找到了与现代月季9个性状相关联的SSR标记。同一位点与多个性状相关联情况很普遍，而这些性状多是同一类性状，这可能是由于性状相关乃至一因多效的遗传基础，如标记NEA21、NEA25、NEA29与叶长、叶宽相关联，而表型性状间的相关性分析也表示出这2个性状是极显著相关的。

找到与表型性状相关联的SSR标记只是第一步，还需对SSR标记进一步进行定位，确定其在现代月季染色体上的具体位置，找到每个标记与其相关联性状的遗传距离，才能更有效的进行现代月季的分子标记辅助育种。

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［3］苏成付．分子标记辅助选择育种发展策略［J］．安徽农业科学，2014，42（15）：4591～4592．

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［5］李桂东．小麦3个重要农艺性状的SSR标记全基因组关联分析［D］．西北农林科技大学硕士学位论文，2015．

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［10］邱彤，张军，张文林，等．基于SSR标记的现代月季遗传多样性研究［J］．北方园艺，2015，14：115～117．

［11］贾元义．月季品种资源的收集、分类和评价［D］．泰安：山东农业大学硕士学位论文，2005．

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［17］强海平，余国辉，刘海泉，等．基于SSR标记的中美紫花苜蓿品种遗传多样性研究［J］．中国农业科学，2014，47（14）：2853～2862．

［18］王凤格，田红丽，赵久然，等．中国328个玉米品种（组合）SSR标记遗传多样性分析［J］．中国农业科学，2014，47（5）：856～864．

［19］李鹤，郭世荣，束胜，等．砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析［J］．园艺学报，2014，41（7）：1379～1390．

Association Analysis of Six Phenotype Traits and SSR Markers in Modern Roses

ZHOU Li-hong1，WANG Jin-gang2，WANG Zhi-gang1，ZHANG Xing3，GONG Shu-fang2FAN Jin-ping2，CHE Dai-di2

（1．Flower Institute，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang，Liaoning 110161； 2．College of Horticulture Science，Northeast Agriculture University，Harbin，Heilongjiang 150030； 3．Daqing branch court，Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing，Heilongjiang 163000）

Association analysis between molecular markers and six complex quantitative traits including fragrance，velour，leaf texture，leaf length，leaf width，and flower diameter were carried out in 80 modern roses varieties collected in our study，for which the correlations between each trait were analyzed by SPSS software procedure．The result showed that the significant correlations were detected between leaf texture and leaf width（R＝－0．370，P＜0．01），leaf length and leaf width（R＝0．917，P＜0．01），leaf width and flower diameter（R＝0．561，P＜0．01），leaf length and the flower diameter（R＝0．558，P＜0．01）．The average values of alleles number and PIC of 24 microsatellite loci were 11．42（2～31）and 0．70．The heterozygosity was from 0 to 0．98 in modern roses，which showed the abundant genetic variations in the group tested．The association between phenotype traits and SSR markers were analyzed by Powermarker software procedure，and SSR markers associated with six traits were successfully found．

Modern rose；Phenotype traits；SSR；Association analysis

S685．12

A

1002－1728（2017）03－0009－06

10．3969／j．issn．1002－1728．2017．03．002

2017－04－11

东北农业大学创新项目（CXZ004）；黑龙江省教育厅海外学人科研资助项目（1154h04）

周俐宏（1984－），女，辽宁盖州人，助理研究员，博士，主要从事花卉资源与育种研究。E-mail：vickyzlh＠1663．com

车代弟（1964－），女，黑龙江哈尔滨，教授，博士，主要从事花卉育种与栽培研究。E-mail：898462546＠qq．com