甜高粱茎秆总RNA提取方法的比较

丛 玲，于惠琳，张丽霞，王春语

（辽宁省农业科学院创新中心，辽宁沈阳 110161）

甜高粱茎秆总RNA提取方法的比较

丛 玲，于惠琳，张丽霞，王春语

（辽宁省农业科学院创新中心，辽宁沈阳 110161）

甜高粱是最具潜力的能源作物之一，新鲜的甜高粱茎秆中含有大量汁液且富含多糖和多酚成分，很难获得高质量的总RNA。以甜高粱Rio的茎秆为实验材料，利用Trizol法、SDS法、改良CTAB法和RNAiso法分别提取新鲜茎秆总RNA，比较几种方法获取的总RNA质量与纯度。实验结果证明，RNAiso改良法提取的茎秆总RNA质量高，完整性好，总RNA产物可直接用于建库和转录组测序等后续实验。

甜高粱；茎秆；总RNA；RNAiso法

甜高粱是最有发展潜力的能源作物之一，其茎秆汁液丰富，含糖量高（茎秆汁液和含糖量分别达到60%和15%以上），经过简单发酵就可以生产乙醇，而且榨汁后残渣还可作为纤维素乙醇的原料，是重要的能源作物，可用于生产糖浆、粮食、乙醇、饲料以及造纸等［1］。加强甜高粱种质资源的创新，选育生物产量高和茎秆含糖量高的能源用甜高粱品种是急需解决的问题［2］。但是，目前甜高粱茎秆含糖量的遗传和分子调控还不清楚，提取完整性好、纯度高的高质量茎秆总RNA是开展甜高粱糖积累相关基因挖掘和分子调控机理研究的前提。目前，提取RNA的常规方法有异硫氰酸胍法、SDS法、苯酚法、Trizol法等。

本实验中主要对SDS法、CTAB改良法、Trizol法和RNAiso法这4种提取方法进行比较，以期提取到满足RNA高通量测序质量要求的完整性好、高纯度的甜高粱茎秆总RNA。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

采用甜高粱Rio品种为实验材料，2016年春季在沈阳大田种植，抽穗期后剪取高粱茎秆。因甜高粱茎秆中含有大量的汁液，出汁率一般在50%～60%，在液氮冷冻情况下，整段的高粱茎秆是很难被粉碎的。预实验中参考王爱勤等的方法，常温下将高粱茎秆榨汁粉碎形成匀浆后提取总RNA，结果提取的RNA均出现严重降解［3］。后经改良，在田间取样时先将茎秆剪成薄片（厚度0．5～1．0 cm），迅速液氮冷冻带回实验室，－80℃保存备用。提取总RNA前，在液氮冷冻条件下，利用小型研磨机（德国IKA A11）将茎秆薄片快速粉碎成粉末，然后再进行后续提取操作。

1.1.2 实验主要试剂

SDS裂解液100 mmol／L LiCl，100 mmol／L Tris，50 mmol／L EDTA，2%SDS，使用前加16% PVP和1%β－巯基乙醇。CTAB提取液100 mmol／L Tris-HCl（pH 8．0），50 mmol／L EDTA，2 mol／L NaCl，2%CTAB，使用前加1%DTT。Trizol reagent试剂购自Invitrogen公司。RNAiso Plus试剂购自大连宝生物（TaKaRa）公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SDS法

按照魏鑫等的方法，取液氮研磨好的茎秆粉末1 g，加入10 ml SDS裂解液进行总RNA提取，最终获得的总RNA提取样品用适量DEPC水溶解，－80℃保存备用［4］。

1.2.2 CTAB改良法

在尹慧等的提取方法基础上，略有修改，加入LiCl沉淀步骤［5］。取液氮研磨好的材料1 g于离心管中，加入10 ml提取液进行总RNA提取。在第一次等体积氯仿抽提后，取上清加入1／3体积的LiCl（12M），－20℃放置6～8 h。4℃12 000 g离心30 min，倒掉上清液，沉淀用约2／5管容积的无菌DEPC水溶解。然后再重复等体积氯仿抽提、无水乙醇沉淀等常规操作，最后适量DEPC水溶解RNA沉淀，－80℃保存备用。

1.2.3 Trizol法

在Trizol reagent产品提供的操作流程基础上，略有修改，加入微量乙醇沉淀步骤。在常规提取步骤的氯仿抽提后，在上层清液中小心加入1／6体积的无水乙醇，冰上静置20 min，然后离心15 min取上清。然后按原操作流程继续异丙醇沉淀等操作，最后加适量DEPC水溶解总RNA提取物－80℃保存备用。

1.2.4 RNAiso法

根据宝生物公司RNA提取试剂（RNAiso Plus）的操作流程进行提取。为去除材料中的多糖成分，加入宝生物公司的植物总RNA提取辅助试剂（Fruit-mateTMfor RNA purification）。每0．1 g液氮研磨的材料加1 ml辅助试剂，混合均匀后离心除去不溶物。向上清液中加入等体积的RNAiso Plus，混匀室温静置5 min，再加入氯仿（RNAiso Reagent的1／5体积量）并混合均匀，室温静置5 min，12 000 g 4℃离心15 min。离心后溶液分为三层，取最上层液转移至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后在室温静置10 min。12 000 g 4℃离心10 min。弃上清，75%乙醇洗涤后室温干燥，加适量DEPC水溶解，－80℃保存。

1.2.5 RNA质量检测

取1 μl总RNA提取产物，以DEPC水为空白对照，在超微量分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop 2000c）上测定RNA在260、280、230 nm下的吸光率，通过换算得出RNA浓度值，并计算A260／A280和A260／230确定RNA的纯度。取1 μl总RNA提取产物，利用1．2%非变性琼脂糖凝胶进行电泳，电压为150 V，电泳30 min。在凝胶成像仪上观察RNA电泳条带，初步分析RNA提取物的清晰度和完整性。因茎秆总RNA提取产物将用于转录组测序等后续的分析研究，对总RNA的完整性要求更高，本实验利用生物分析仪（Agilent 2100 Bioanalyzer）检测总RNA提取物的浓度和RIN值，精确评价RNA的完整性［6，7］。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法茎秆总RNA的完整性比较

各种方法提取的RNA样品的电泳结果见图1。图1-A是SDS法提取总RNA电泳图，可见28 s部分降解，5 s条带亮度高于28 s和18 s，且有少量DNA污染，28 s条带上方出现大量弥散拖尾现象，说明多糖、蛋白质污染严重。图1-B是CTAB改良法的电泳结果，可见28s、18s rRNA条带明显降解，5s条带亮度远高于28s和18s条带，虽然没有蛋白质、DNA等污染，总RNA完整性已完全破坏。用Trizol法提取的总RNA，电泳（图1-C）显示28s条带稍有降解，无蛋白等污染。图1-D是RNAiso法提取总RNA的电泳图，可见28 s、18 s rRNA条带分离明显清晰，28 s、18 s条带亮度比5 s大，表明其完整性良好；点样孔中无DNA残留痕迹，28 s条带上方无弥散拖尾现象，说明没有多糖、蛋白等杂质的污染。

因SDS法和CTAB改良法提取的总RNA已经大量降解，不适合后续实验，所以本实验将Trizol法和RNAiso法提取的RNA利用生物分析仪（Agilent 2100 Bioanalyzer）进行检测，进一步测定总RNA提取物的浓度、纯度和RIN值，精确RNA的完整性。图2显示的是两种方法的总RNA样品毛细管电泳报告。从图中可以看出，2-A（RNAiso法）的RNA样品28 s峰和18 s峰清晰可见，无杂峰；2-B（Trizol法）中18 s峰后面存在些许杂峰，这与琼脂糖电泳的结果基本一致。

图1 不同提取方法获得的总RNA琼脂糖电泳结果A，SDS提取法；B，CTAB改良法；C，Trizol法；D，RNAiso法。

图2 总RNA产物的毛细管电泳结果（Agilent 2100 Bioanalyzer）A，RNAiso法总RNA提取物；B，Trizol法总RNA提取物。

2.2 不同提取方法茎秆总RNA的纯度比较

将4种不同方法提取的总RNA进行紫外分光光度计纯度分析，分别测量在230、260、280 nm下的吸光度值，高纯度RNA的A260nm／A280nm的比值应介于1．8～2．0，A260nm／A230nm应大于1．7。RIN值是指RNA integrity number，即RNA分子完整数，是Agilent 2100生物分析仪系统中针对真核生物总RNA Nano分析法采集样品开发的一种统计方法［7］。RIN值的数值从0～10，数值越大表明RNA质量越好、越完整，直接反映了RNA质量的高低，只有RIN值＞8的RNA样品，能够满足文库建库、转录组测序等研究要求。表1中列出了上述4种方法提取RNA样品的浓度、吸光度比值等多个纯度指标。从表1看出，用改良CTAB法、SDS法、Trizol法以及RNAiso法提取的总RNA的A260nm／A280nm的比值都大于1．8，但改良CTAB法和SDS法提取的总RNA的D260nm／D280nm比值大于2．0，说明含有高盐和酚等杂质的污染。Trizol法和RNAiso法提取的RNA样品的浓度和纯度都比较好，但Trizol法提取的总RNA浓度明显低于RNAiso法，而且完整性差，RIN值低于8，不能满足转录组测序实验的要求。

表1 不同方法提取甜高粱茎秆总RNA的结果比较Table 1 Comparison of total RNA from the stem of sweet sorghum by different methods

3 结论与讨论

3.1 多糖去除对提取结果的影响

多糖污染是甜高粱茎秆总RNA提取中遇到的棘手难题。多糖的许多理化性质与RNA相似，在提取中与RNA以复合体形式存在，很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也会被除去，造成RNA提取效率的大幅度降低和降解。目前去除植物多糖的方法主要有3种：一是用高浓度的Na＋、K＋改变多糖的溶解特性，使其脱离水相进入有机相，然后用酚氯仿抽提去除［8］；二是在沉淀RNA之前采用乙二醇丁醚、乙醚或丁氧乙醇等把多糖去掉［9］；三是选择性沉淀多糖或RNA。LiCl可以选择性地沉淀RNA，去除大部分多糖，但实验周期较长，沉淀RNA一般都需要至少2 h以上的冰浴。在本实验中SDS和CTAB方法中都加入LiCl沉降的步骤，但仍然是难以去除多糖污。这可能与甜高粱茎秆组织中含糖量过高有关。另有文献报道，低浓度的乙醇（10%～30%）可以沉淀多糖，而RNA则要在75%乙醇中才能沉淀下来，所以可以利用RNA与多糖在不同浓度乙醇中沉淀性不同来分离这2种物质［10］。本文中，在常规Trizol试剂提取过程中加入一步低浓度无水乙醇去除多糖的步骤，但效果不理想，虽然有效去掉了多糖污染，但造成了RNA提取物的部分降解。而RNAiso方法中，TaKaRa植物RNA提取辅助试剂Fruit-mateTMfor RNA purification的加入，则既有效去除了植物多糖污染，又保证了RNA样品的完整性，因此可以获得质量较高的总RNA。

3.2 不同提取方法的分析比较

根据结果可知，4种提取方法中，RNAiso法提取的甜高粱茎秆总RNA完整性好、纯度高、浓度高，适合于RNA测序等下游后续实验的使用。SDS法和CTAB法提取的总RNA存在降解，并含有杂质，效果不够理想，不适用于RNA测序的实验要求。Trizol法提取的茎秆总RNA虽然在电泳和紫外分光光度测定的检测中，质量基本达标，但经Agilent 2100生物分析仪系统的检测中，RIN值偏低，完整性不如RNAiso法，可以进行RNA反转录PCR等简单分子生物学实验，但无法满足RNA测序的高纯度要求。

综上所述，针对RNA高通量测序的实验要求，甜高粱茎秆总RNA的提取应采用RNAiso法进行。

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［3］王爱勤，范业赓，赵晓艳，等．甘蔗茎RNA提取方法的比较［J］．广西农业生物科学，2007，262（2）：175－178．

［4］魏鑫，李玥莹，关尔鑫．甜高粱总RNA提取方法的比较研究［J］．江苏农业科学，2011，39（3）：45－47．

［5］尹慧，陈莉，李晓艳，等．百合叶片总RNA提取方法比较及优化［J］．中国农业大学学报，2008，13（4）：41－45．

［6］Mueller O，Hahnenberger K，Dittmann M，et al．A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation［J］．Electrophoresis，2000，21（1）：128～34．

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Comparison and Analysis of the Methods of RNA Isolation From Sweet Sorghum Stems

CONG Ling，YU Hui-lin，ZHANG Li-xia，WANG Chun-yu
（Innovation Center，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang，Liaoning 110161）

Sweet sorghum is a kind of promising energy crops．There are large amounts of juice andrich in polysaccharides and polyphenols in fresh stem of sweet sorghum，so it is very difficult to obtain high quality total RNA by common RNA extraction methods from the fresh stem．In this study，the total RNA of Rio stem was extracted by Trizol method，SDS method，modified CTAB method and RNAiso method respectively．The results showed that the total RNA extracted usingRNAiso method is of high quality and good integrity，and can be used directly for subsequent experiments such as database construction and transcriptome sequencing．

Sweet sorghum；Stem；Total RNA；RNAiso method

Q813．4；S514

B

1002－1728（2017）03－0024－04

10．3969／j．issn．1002－1728．2017．03．005

2017－04－18

国家自然科学基金青年基金项目（31501241）；辽宁省自然基金项目（2015020788）

丛玲（1980－），女，博士，助理研究员，主要从事高粱分子育种研究。E-mail：ling_1860＠163．com