分子标记辅助选育携带抗稻瘟病基因Pi65（t）的水稻新品种

赵家铭，王丽丽，马作斌，王昌华，郑文静

（辽宁省农业科学院创新中心，辽宁沈阳 110161）

分子标记辅助选育携带抗稻瘟病基因Pi65（t）的水稻新品种

赵家铭，王丽丽，马作斌，王昌华，郑文静

（辽宁省农业科学院创新中心，辽宁沈阳 110161）

港育129携带主效抗稻瘟病基因Pi65（t），以港育129为父本，辽星1号为母本，F1代与辽星1号回交，用连锁标记InDel-1对BC1F2代进行筛选，从中选取农艺性状与辽星1号相似且携带纯合Pi65（t）的单株进行花药培养，获取优质抗病新品系辽粳168，2014年参加辽宁省水稻区域试验晚熟组，2017年通过辽宁省农作物品种审定委员会审定。

稻瘟病分子育种抗病基因

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一种世界性的稻作病害，在世界各水稻产区每年都有不同程度的发生（Zeigler RS et al．，1994）［1］。该病发生时产量一般减少10%～20%，较严重的地区可达40%～50%，局部区域甚至颗粒无收（Kush GS et al．，2009；Liu J L et al．，2010）［2～3］。我国北方粳稻年栽培面积达466．7万hm2以上，占全国粳稻生产面积近60%。近20年来，尽管在高产育种上有巨大突破，但由于稻瘟病菌复杂多变，且品种抗谱狭窄，加之品种单一化大面积种植，导致很多育成的超级稻品种推广几年即丧失了抗性。改良这些主栽水稻品种的抗性，同时不改变其原有的高产优质等优良农艺性状，是广大育种者一直追求的目标。随着分子标记技术的普及，利用杂交、回交，采用分子标记辅助导入及聚合主效抗稻瘟病基因已成为目前抗病育种的主要方向（Fukuoka S et al．，2009）［4］。

多年来，抗稻瘟病分子标记辅助育种也取得了巨大的成就，携带不同抗病基因的水稻品种已在生产中不同程度得到应用（王忠华等，2004；陈学伟等，2004；胡景涛等，2010；郭振华等，2013；梁毅等，2013；田红刚等，2016；王飞等，2016）［5～12］。港育129是由辽宁省东港市农业技术推广中心育成并于2009年经辽宁省品种审定委员会审定的水稻品种，经人工接种，该品种对辽宁地区流行的多个生理小种均表现抗病。项目组前期利用SLAF-BSA技术从港育129中定位到一个抗稻瘟病基因Pi65（t），并筛选到一个与该基因紧密连锁的分子标记InDel-1（Zheng et al．，2016）［13］，本研究以港育129和辽星1号为亲本，通过杂交、回交及后代的分子标记辅助选择及花药培养育成了一个水稻新品种，其农艺性状与辽星1号较为相似，且携带主效抗稻瘟病基因Pi65（t）。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗病供体亲本港育129，感病受体亲本辽星1号，均由辽宁省农业科学院创新中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 杂交与回交

2010年初在海南以港育129号为父本，以辽星1号为母本杂交获得F1。2010年夏在沈阳以辽星1号为母本，以F1为父本回交，获BC1F1，2010年冬BC1F1在海南自交，获BC1F2。

1.2.2 杂交后代的分子标记辅助选择

从BC1F2中选择株型与辽星1号相似的单株，采用改良的CTAB法提取叶片DNA，利用In-Del-1F：5’-ATCTTACCTC AACATTGCC-3’和In-Del-1R：5’-AGACATGTTG AAGACGCCT-3’进行基因扩增，PCR反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix（艾德莱PC0902）10 μl，10 μm的引物各0．5 μl，100 μg／ml的模板DNA 1 μl，ddH2O 8 μl［14］。PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸70 s，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。取4 μl PCR产物，利用6%聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定各个体基因型，筛选只获得一条长约140 bpPCR产物的个体，从田间取其单核靠边期花药，按照郑文静等的方法进行花药培养［15］。

20世纪80年代，根策尔拜入激光发明者之一、诺贝尔奖得主、物理学家查尔斯·汤斯（Charles Townes）的门下，进入加州大学伯克利分校作博士后研究。他曾在最近的一次电话访谈中表示：“汤斯对我很好，我觉得自己就像是他的小儿子一样。”正是从那时起，根策尔对银河系中心的这个黑暗天体产生了兴趣。

1.2.3 纯合品系的产量比较试验

将通过花药培养获得的纯合品系连同对照品种辽星1号种植于田间，小区面积4．8 m2，随机区组设计，3次重复，秋季收获，测产。

1.2.4 品种区域试验

2012年至2013年在沈阳、东港和庄河分别进行了品种比较试验及小面积示范，选出产量高、米质优及高抗稻瘟病的材料创新1号（品比编号DH170）。2014年参加辽宁省水稻区域试验晚熟组预备试验，2015～2016年参加辽宁省水稻区域试验晚熟组，更名为辽粳168。2016年同时参加辽宁省水稻生产试验晚熟组。

2 结果与分析

2.1 利用Pi65（t）连锁标记InDel-1检测BC1F2代个体

在抗病鉴定圃中种植港育129／辽星1号BC1F2群体（单株插秧），根据株型及生育期等从BC1F2中选择农艺性状与辽星1号相似的单株，取叶片提取DNA，利用InDel-1进行PCR扩增，同时记录各单株的稻瘟病抗病结果，由图1可见，BC1F2群体中各个体在Pi65（t）位点呈现分离，其中与港育129基因型一致的即只扩增出1条长度约140 bp片段的个体均对稻瘟病表现抗病。

2.2 品种比较试验结果

取所筛选的筛选25个携带纯合Pi65（t）的单株单核靠边期花药，通过花药培养获取再生植株800余株，冬季移栽于海南后收获205个纯合株系。从中选取了农艺性状与辽星1号接近的12个品系DH1、DH23、DH31、DH32、DH36、DH86、DH109、DH110、DH130、DH170、DH180和DH201，以辽星1号为对照进行产量比较试验，方差分析结果表明，参试水稻品系间产量差异达显著水平（表1）；其中DH170平均产量771．37 kg／667m2，较对照辽星1号增产显著，在14个品系中排名第1；而DH1、DH23、DH32、DH36、DH86、DH109、DH110、DH130、DH180和DH201产量与辽星1间差别不显著；DH31平均产量为587．12 kg／667m2，显著低于其它品系（表2）。

2.3.1 参试过程及产量表现

2014年将排名第1的品系DH170命名为“创新1号”，参加了辽宁省水稻区域试验预备试验（晚熟组）。试验结果表明该品系在丹东、庄河和普兰店对稻瘟病均表现高抗，且平均产量683．5 kg／667m2，比对照金禾1号增产8．3%，在32个参试品种中排名第1位。

2015～2016年创新1号更名为辽粳168，参加辽宁省水稻区域试验（晚熟组），14点次均增产，两年平均产量613．4 kg／667m2，比对照金禾1号增产11．7%；2016年参加同组生产试验，平均产量555．2 kg／667m2，比对照金禾1号增产8．8%。

2.3.2 农艺性状

生育期162 d左右，属晚熟品种。苗期叶色浓绿，叶片上冲，株高110．0 cm，株型紧凑，分蘖力较强，主茎16片叶，半散穗型，穗长17．4 cm，穗粒数119．9粒，千粒重26．8 g，颖壳黄褐色，有芒。

2.3.3 米质检测结果

经农业部稻米及制品质量监督检验测试中心（杭州）测定，糙米率82．3%，精米率72．9%，整精米率71．4%，粒长5．2 mm，籽粒长宽比2．0，垩白粒率3%，垩白度0．2%，透明度2级，碱硝值7．0，胶稠度69 mm，直链淀粉17．6%，蛋白质7．7%，米质优。

2.3.4 抗病检测结果

经2015～2016两年田间穗颈瘟病情鉴定调查，抗穗颈瘟。

图1 分子标记Indel-1在港育129／辽星1号BC1F2群体中基因型

表1 各品系产量方差分析

表2 参试各品系产量比较 （kg／667m2）

3 讨论

传统的水稻抗病育种依赖于表型鉴定和抗性鉴定的结果进行选择，要求育种者具有丰富的经验，需要多年的育种周期，并且还受病原菌、温湿度、光照等气候因素影响，选择的结果容易造成误差，甚至造成抗性基因的丢失，选择效率往往较低［16］。分子标记辅助选择育种是基于标记基因型进行分析和选择，其筛选结果不受环境因素影响，故能极大提高抗病植株选择的准确性和育种效率［17］。杨丰宇等在研究中利用共显性标记对稻瘟病抗性表型的选择效率可达到100%［16］。孙永建等利用分子标记辅助选择的方法改良了水稻恢复系R997对稻瘟病的抗性，认为这种育种方法既能缩短基因定位研究与育种应用的距离，又可以减少费用和育种年限，提高筛选效率［18］。

本研究利用抗稻瘟病基因Pi65（t）的连锁标记InDel-1辅助选择，成功从港育129／辽星1号BC1F2群体中筛选出12个携带纯合Pi65（t）且农艺性状与感病亲本辽星1号相似的品系，经鉴定，这些材料均对稻瘟病表现抗病，表明利用InDel-1进行抗病基因Pi65（t）的前景选择效率及准确性均较高。由于本研究选用的抗病育种亲本港育129与辽星1号农艺性状相似，两品种间仅存在生育期、产量及抗性方面的差异，故在杂交后代的背景选择方面仅根据田间调查数据进行判断即可获取理想的结果。但在抗病分子改良的过程中，如果父母本间差异较大、后代分离较为显著时，除利用抗病基因的连锁标记进行前景选择外，尚需利用芯片或不用品种间的多态性SSR标记来鉴定不同材料的遗传背景，从而可获得抗性提高且农艺性状与需改良感病亲本相似的个体，最大限度保持原有品种的优异性状。

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［5］王忠华，贾育林，吴殿星，等．水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记辅助选择［J］．作物学报，2004，30（12）：1259～1265．

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S511．03

B

1002－1728（2017）03－0028－04

10．3969／j．issn．1002－1728．2017．03．006

2017－06－08

国家自然科学基金项目（31571993）；国家重点研发计划项目（2017YFD0100500）

赵家铭（1981－），男，辽宁海城人，硕士，副研究员，从事水稻抗病分子改良工作。E-mail：zhaojiaming2011＠126．com

郑文静（1974－），女，吉林公主岭人，博士，研究员。E-mail：zwj27＠126．com