响应面试验优化东北黄豆酱制曲工艺

高雅文，徐静源，李鸿梅*

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

响应面试验优化东北黄豆酱制曲工艺

高雅文，徐静源，李鸿梅*

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

以黄豆和面粉为主要原料，采用混合菌种制曲，以蛋白酶、淀粉酶的活性为评价指标，利用Box-Behnken响应面试验考察不同工艺条件对豆酱曲酶活的影响。试验结果表明，采用添加熟面粉的方式，湿豆与面粉质量比10∶4、接种量0.07%、制曲时间48 h，在此最佳制曲工艺条件下，蛋白酶酶活为1 049.83 U/g，淀粉酶酶活为781.29 U/g。

黄豆酱；制曲工艺；酶活

黄豆酱又称大豆酱、豆酱，用黄豆熟制磨碎后接菌发酵而成，是我国传统的调味酱[1-2]。豆酱有浓郁的酱香和酯香，咸甜适口，用于蘸、焖、蒸、炒、拌等各种烹调方式，也可佐餐、净食等，是深受广大消费者喜爱的调味食品[3-4]。

豆酱制作过程中，培养有益微生物进行食品发酵的过程被称之为制曲。制曲过程中，微生物在原料上生长繁殖，分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶系[5]，为后期发酵所用。后期发酵过程中，黄豆中的酶和微生物产生的酶将蛋白质降解为多肽和多种氨基酸，淀粉降解为糊精，低聚糖和单糖，并且这些物质相互协调作用，共同影响着黄豆酱的色、香、味和体态[6-8]。因此，制曲过程，酶的活性直接影响着原料的利用率和最终产品的风味，色泽和体态。

近年来，有关单一菌种酱曲制备、酱油曲制备、蚕豆酱曲制备等研究较多，如陈玲[9]研究了制曲时间对酱曲中蛋白酶、纤维素酶、糖化酶、淀粉酶四种酶的酶活力变化的影响。乌日汗[10]研究了米曲霉培养时间、接种量、制曲时间、制曲温度对粟米酱曲中蛋白酶活力及生长状况的影响。有学者[11]对国内外三种优良酱油生产米曲霉菌株的制曲性能进行研究，分析了中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等重要酶系的酶活变化趋势，但混合菌种制黄豆酱曲的报道较少，并且面粉添加量对黄豆酱曲中酶活的影响研究未见报道。

米曲霉中性和碱性蛋白酶活性较强，而酸性蛋白酶活性相对较低；黑曲霉酸性蛋白酶、糖化酶、纤维酶等活性均较强，2种曲霉混合制曲可以起到酶系互补，提高原料转化率，提升产品品质的作用[12]。本试验采用米曲霉和黑曲霉混合菌种制曲，通过控制湿豆与面粉质量比、接种量和制曲时间，研究三者在黄豆酱制曲过程中对蛋白酶和淀粉酶活性的影响，优化最佳工艺条件以期为工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

面粉、黄豆：市售；米曲霉曲精（活性孢子数200×108个/g，出芽率90%）、黑曲霉曲精（活性孢子数200×108个/g，出芽率90%）：山东沂源康源生物科技有限公司；福林试剂、酪素、酪氨酸：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

JYL-F20九阳料理机：九阳股份有限公司；AL204电子天平：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；TDL-5-A低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；SHP-250型生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；WFJ2100型可见分光光度计：尤尼科（上海）仪器有限公司；DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；C21-RH2112多功能电磁炉：广东美的生活电器制造有限公司；LX-B150L立式灭菌锅：合肥华泰医疗设备有限公司

1.3 试验方法

1.3.1 制曲工艺流程及操作要点

操作要点：将黄豆洗净后，加水浸泡12 h，检出不饱满籽粒，121℃蒸煮15 min，将生面粉放入蒸锅，开锅蒸煮15min，200g黄豆和定量面粉降温至40℃以下混合于500mL烧杯中，接入定量的米曲霉曲精、黑曲霉曲精混合菌种（m米曲霉∶m黑曲霉=3∶2）[13-15]，置于培养箱，24 h之内曲温控制在33～34℃，24h翻曲使酱曲温度降至27～28℃，培养箱温度调至27～28℃，24～48h控制在27～28℃，期间翻曲2～3次，得成曲。

1.3.2 单因素试验

湿豆与面粉的质量比对豆酱曲酶活性的影响：制曲温度24h之内33～34℃，24～48h为27～28℃，接种量为0.06%，制曲时间为48h，湿豆与面粉质量比为10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5，考察湿豆与面粉的质量比对豆酱曲酶活性的影响。

接种量对豆酱曲酶活性的影响：制曲温度24h之内33～34℃，24～48 h为27～28℃，制曲时间为48 h，湿豆与面粉质量比为10∶4，接种量为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%，考察接种量对豆酱曲酶活性的影响。

制曲时间对豆酱曲酶活性的影响：制曲温度24 h之内33～34℃，24～52 h为27～28℃，接种量为0.06%，湿豆与面粉质量比为10∶4，制曲时间为36 h、40 h、44 h、48 h、52 h，考察制曲时间对豆酱曲酶活性的影响。

1.3.3 Box-Behnken响应面试验优化方案

在单因素试验基础上，以湿豆与面粉质量比（A）、接种量（B）、制曲时间（C）为主要因素，以蛋白酶活力（Y1），淀粉酶活力（Y2）为考核指标，进行Box-Behnken响应面试验，因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 测定方法

蛋白酶活性的测定：将成曲用搅拌机打碎，准确称取5.000 g曲样，用少量适宜的磷酸缓冲液溶解并用玻璃棒捣研，然后将上清液倒入100 mL容量瓶，沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次，最后全部移入容量瓶，定容。采用蛋白酶活性的测定方法（GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》福林法）测定其酶活性[16]。

淀粉酶活性的测定：将成曲用搅拌机打碎，准确称取2.000 g曲样，转移到50 mL容量瓶用蒸馏水定容至刻度，40℃水浴振摇30 min，于5 000 r/min离心7 min，取上清液备用。采用3,5-二硝基水杨酸法测定其酶活性[17]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验设计

2.1.1 湿豆与面粉的质量比对豆酱曲酶活性的影响

图1 湿豆与面粉质量比对酶活性的影响Fig.1 Effect of wet beans and flour mass ratio on enzyme activity

由图1可知，随着面粉含量的增加，使得微生物生长所需的碳源、氮源比例趋于合理，满足微生物大量生长繁殖的需求，所分泌出来的蛋白酶，淀粉酶大量增多，并且酶活力逐渐加大，湿豆与面粉质量比为10∶4时，蛋白酶、淀粉酶活性最强，面粉比含量继续增加，蛋白质降解产物氨基酸和淀粉降解产物葡萄糖发生美拉德反应消耗一部分微生物生长所需的营养物质，使酶活下降。综合考虑，选取湿豆与面粉质量比为10∶3、10∶4、10∶5进行响应面试验。

2.1.2 接种量对豆酱曲酶活性的影响

图2 接种量对酶活性的影响Fig.2 Effect of inoculum on enzyme activity

由图2可知，接种量为0.06%时酶活性最高，添加量过少，会直接影响微生物最终的生产总量，导致酶活性低，而接种量过高，菌体数量增多，原料中氧气和可利用的营养物质竞争性增加，不利于微生物生长，影响孢子的成熟，影响蛋白酶、淀粉酶的产生，导致酶活性低。综合考虑，选取接种量0.04%、0.06%、0.08%进行响应面试验。2.1.3制曲时间对豆酱曲酶活性的影响

图3 制曲时间对酶活性的影响Fig.3 Effect of koji-making time on enzyme activity

经过第一次翻曲后，有白色菌丝生成，第二次翻曲后，产生大量白色菌丝，随着时间增加，微生物活性增强，44 h时淀粉酶活性达到最高，48 h时蛋白酶活性达到最高，随后活性降低。酱曲中米曲霉、黑曲霉利用酱曲中的营养物质进行自身的生长繁殖，菌体数量随时间增加而增多，分泌的酶量越来越多，酶活逐渐增大，随着制曲时间的延长，曲霉孢子处在生长后期，酶的活性逐渐下降。因此，选取制曲时间44 h、48 h、52 h进行响应面试验。

2.2 回归方程的建立与分析

2.2.1 响应面试验结果及分析

在单因素试验的基础上，利用响应面法选择最佳工艺，试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

采用Design-Expert8.0.6软件对所得数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型为：

蛋白酶酶活Y1＝1 015.04+24.54A+91.27B+32.01C-24.05AB-12.92AC-4.88BC-70.22A2-60.12B2-149.90C2

淀粉酶酶活Y2＝747.28+49.45A+90.63B+36.31C-14.06AB-1.34AC-17.12BC-109.50A2-70.56B2-154.99C2

表3 以蛋白酶酶活为评价指标的回归模型方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression model using protease activity as evaluation index

表4 以淀粉酶酶活为评价指标的回归模型方差分析结果Table 4 Variance analysis results of regression model using amylase activity as evaluation index

对模型进行回归方程系数显著性分析结果见表3，表4。蛋白酶活性评价模型中，一次项A、B、C，二次项AB、A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），二次项AC影响显著（P＜0.05），响应面回归模型达到极显著水平（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明该二次模型能够拟合真实的试验结果。淀粉酶活性模型中一次项A、B、C，二次项BC、A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），二次项AB影响显著（P＜0.05），响应面回归模型达到极显著水平（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明该二次模型能够拟合真实的试验结果，可用于黄豆酱制曲工艺条件对蛋白酶和淀粉酶酶活影响的研究。

2.2.2 各因素间交互作用的影响

各因素之间交互作用对酱曲中蛋白酶活性和淀粉酶活性影响的响应面如图4所示，各试验因素对酱曲中蛋白酶活性和淀粉酶活性的影响不是简单的线性关系。

图4 湿豆与面粉质量比、接种量、制曲时间交互作用对酱曲中蛋白酶活性和淀粉酶活性影响的等高线及响应面图Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of wet beans and flour mass ratio,inoculum,koji-making time on protease activity and amylase activity

由Design-Expert软件分析得到响应面值最大时对应的最佳条件是湿豆与面粉质量比10∶4.13、接种量0.073 4%、制曲时间48.32 h，蛋白酶酶活理论值为1 050.35 U/g，淀粉酶酶活理论值为780.637 U/g。为了方便实际操作，对试验条件进行简化，选取湿豆与面粉质量比10∶4、接种量0.07%、制曲时间48 h，三组平行试验取平均值，蛋白酶酶活为1 049.83 U/g，淀粉酶酶活为781.29 U/g，与理论值基本相符，因此以蛋白酶酶活和淀粉酶酶活为检测指标，响应面法优化黄豆酱制曲工艺条件是可行的。

3 结论

本试验重点研究了湿豆与面粉质量比、接种量、制曲时间对蛋白酶酶活和淀粉酶酶活的影响，采用Box-Behnken试验对黄豆酱制曲工艺条件进行了优化。得出最佳的工艺条件为：湿豆与面粉质量比10∶4、接种量0.07%、制曲时间48 h，三组平行试验取平均值，蛋白酶酶活为1 049.83 U/g，淀粉酶酶活为781.29 U/g。

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Optimization of koji-making technology of northeast soybean paste by response surface experiments

GAO Yawen,XU Jingyuan,LI Hongmei*
(College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

Using soybean and wheat flour as main raw material,protease and amylase activity as evaluation indexes,the effect of different koji-making conditions on koji enzymatic activity of soybean paste was investigated by Box-Behnken response surface experiments.The results indicated that the protease activity and the amylase activity were 1 049.83 U/g and 781.29 U/g,respectively,with the conditions of adding cooked flour,wet beans and flour ratio 10∶4,inoculum 0.07%,and koji-making time 48 h.

fermented soybean paste;koji-making;enzyme activity

TS264.2

0254-5071（2017）06-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.019

2017-02-07

校企联合横向课题

高雅文（1972-），女，副教授，硕士，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：李鸿梅（1971-），女，教授，博士，研究方向为发酵工程。