高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

汪文鹏，李永博，吴树坤，刘梅，邓杰，卫春会，黄治国*

（四川理工学院生物工程学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

汪文鹏，李永博，吴树坤，刘梅，邓杰，卫春会，黄治国*

（四川理工学院生物工程学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

该试验从高温大曲中筛选产吡嗪芽孢杆菌（Bacillus），通过形态观察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析对其进行鉴定，并采用发酵试验分析其代谢产物。共筛选出3株芽孢杆菌，即菌株B1、B2、B3。经分析鉴定后得出：菌株B1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌发酵产物分析结果表明，在液态发酵条件下3株菌发酵产吡嗪，其中菌株B2和B3发酵产物中吡嗪相对含量较高，均＞60%；固态发酵条件下生成吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮，且发酵产物中相对含量均＞75%。表明这3株芽孢杆菌对酱香型白酒风味物质的产生有着一定的影响。

高温大曲；芽孢杆菌；吡嗪

吡嗪是含氮的六元环化合物，其衍生物广泛存在于天然和发酵食品中，是白酒中含氮化合物的主要成分，同时也是白酒香味成分的重要组成物质。研究表明，吡嗪类化合物是酱香型白酒的特征风味物质，在风味物质中其种类和含量最高，其中四甲基吡嗪也是公认的功能因子，具有扩张血管、改善血循环、护肝等功能[1-2]。吡嗪类化合物与酱香型白酒的感官特征密切相关，其含量高低影响酱香白酒的品质[3-7]。由于食品烘焙过程中羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）会发生非酶促的美拉德反应，二羰基化合物与氨基酸经Strecker降解反应会产生吡嗪类化合物[8]，因此，长期以来一直认为中国白酒中的吡嗪主要由美拉德反应产生[9-10]。但在酱香型酒的高温制曲环节、高温堆积环节、高温发酵环节产生的吡嗪类化合物，除了褐变反应生成外，有相当部分是微生物的代谢产物[11-12]。芽孢杆菌代谢不仅能产生大量胞外酶（如蛋白酶、淀粉酶等），从而在发酵前期积累各种多肽、氨基酸和还原糖类，还能产生如乙偶姻[13-14]、四甲基吡嗪[15]等物质。早在1962年，日本研究者在纳豆中分离得到四甲基吡嗪，并且研究发现，其中的枯草芽孢杆菌具有发酵产生四甲基吡嗪的能力，证明了发酵食品纳豆中的四甲基吡嗪来自于微生物的代谢反应。1972年，又有研究者从发酵的可可豆中找到了发酵产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌，并发现只有在枯草芽孢杆菌生长时，体系中才会有四甲基吡嗪产生，这也证明了发酵可可豆中的四甲基吡嗪是由枯草芽孢杆菌产生的。因此，本实验以高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌作为筛选目标和研究对象，采用平板分离法，结合磷脂脂肪酸（phospholipid fattyacid，PLFA）技术和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析技术对高温大曲中的产吡嗪芽孢杆菌进行研究。以期为从细菌方面间接提升酱香型白酒酒质的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

大曲样品采自四川某酱香型酒厂生产用高温大曲。

1.1.2 试剂

体积分数95%乙醇溶液、甲醇、葡萄糖、氯化钾、硝酸钠、硫酸镁、结晶紫、番红、硫酸亚铁、硝酸钾、氢氧化钠、氯化钠（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；正己烷（色谱纯）：德国Darmstadt公司；甲基叔丁基醚（色谱纯）：德国Tedia公司。

牛肉膏蛋白胨培养基：称取牛肉膏5 g，琼脂20 g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水至1 000 mL，pH调至7.0～7.2，121℃灭菌15 min。

营养肉汤培养基：称取牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，加水至1 000 mL，pH调至7.0～7.2，121℃灭菌15 min。

高粱固体培养基：将高粱粉置于纱布上，并加入少许水润湿，盖上锅盖蒸至有高粱香，将蒸好的高粱按30 g每份分装至100 mL锥形瓶中，并向每个锥形瓶中加入10 mL水，121℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

7890A-5978B型气相色谱-质谱联用仪、GC6890型气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；HT300A型全自动固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）仪：意大利HTA公司；Sherlock602型微生物鉴定系统：美国MIDI公司；Scan1200型全自动菌落分析仪：上海智理科学仪器有限公司；DM3000型正置生物显微镜：德国徕卡公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株筛选

分离纯化：无菌称取10 g大曲样品，在无菌操作台上迅速加入装有90 mL无菌水的三角瓶中，充分摇匀，振荡5～10 min。使大曲充分打散，即制成10-1稀释样。取1 mL上清液加入9 mL无菌生理盐水中，配制成10-2菌悬液。依次类推，配制成10-3、10-4……10-7菌悬液。分别吸取0.2mL10-3～10-7稀释度菌悬液，迅速用涂布棒均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，每个稀释度做3个平行样，于37℃培养箱中倒置培养24 h。挑取长势较好的单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用4区划线法对取得的单菌落进行划线分离纯化，将得到的单菌落保藏于牛肉膏蛋白胨培养基，待菌落长出后，4℃冰箱保藏备用。

产吡嗪验证：从新鲜斜面培养基上挑取一环菌落至装液量为20 mL/100 mL的营养肉汤培养基中于37℃、150 r/min条件下培养3 d。吡嗪的前体物质即3-羟基-2-丁酮，因此，通过借助VP试验[14]检测3-羟基-2-丁酮，筛选产吡嗪菌株。

1.3.2 形态观察

将分离纯化后的细菌进行革兰氏染色和制片，通过光学显微镜进行观察，对细菌的形状、大小、芽孢和包囊等状况进行记录。

1.3.3 菌种鉴定

（1）试剂的配制

皂化试剂：将75 mL水和75 mL甲醇混合，加入22.5 g固体NaOH，边加边搅拌，直至固体完全溶解。

甲基化试剂：将32.5mL6mol/L的盐酸溶液加入27.5mL甲醇中，搅拌混匀。

萃取试剂：将100mL甲基叔丁基醚加入100mL正己烷中，并搅拌均匀。

碱洗涤：将3.6 g NaOH加入300 mL去离子水中，同时搅拌至完全溶解。

（2）菌株获取

采用四区划线法将筛选菌株接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基中，37℃培养24 h。用接种环挑取第三区的菌落（约40 mg）于螺旋试管底部，菌量宁多勿少，同时做好标记。注意小心挑种，不要将培养基带入，以免影响结果。

（3）皂化与甲基化

取1.0mL的皂化试剂注入试管内，将螺旋管旋紧，振荡5～10 s后95～100℃水浴5 min，取出试管再振荡5～10 s，95～100℃水浴25 min后取出，冷却至室温后，加入2.0 mL的甲基化试剂旋好盖子，振荡5～10 s，80℃水浴10 min，取出试管，冷却至室温。

（4）萃取与碱洗涤

在螺旋试管中加入1.25 mL萃取试剂，旋好盖子后，将试管上下颠倒混合10 min，注意来回混合，防止气泡产生，然后静置分层。用灭菌滴管吸出下层液体，而保留上层液体。加入3.0 mL的碱洗涤，旋好盖子，缓慢将试管上下颠倒混合5min，静置分层。若分层不明显，加少许饱和的氯化钠溶液，然后用灭菌的玻璃滴管吸取2/3的上清液，移至GC小管内。保存于4℃冰箱中待检。

（5）MIDI鉴定系统的菌相分析[16]

将待检样品用气相色谱仪进行鉴定。利用相关数据库（TSBA6 6.21，CLIN6 6.20，FUNGI 3.80）和MIDI鉴定系统分析，鉴定样品中微生物的种类。

色谱条件：19091B-102毛细管色谱柱（25.0 m×0.2 mm× 0.33 μm）；进样口温度250℃；分流比30∶1；程序升温：初始温度190℃，10℃/min升至280℃，60℃/min升至310℃，保持1min；火焰离子检测器（flame ionization detector，FID）温度300℃；载气：氢气30 mL/min；助燃气：空气3 500 mL/min；尾吹气：氮气30 mL/min；进样量：2 μL。

1.3.4 发酵产物分析

液态发酵：将菌株接种至装液量为50 mL/500 mL的营养肉汤培养基中，于37℃、150r/min摇床中发酵3～4 d。

固态发酵：将菌株接种至高粱固体培养基中，于37℃、150 r/min摇床中发酵3～4 d。

固相微萃取条件：精确量取4 mL液态发酵样品（或4 g固体发酵样品）于顶空瓶中，将顶空瓶放入全自动固相微萃取仪中，65℃平衡10 min后，萃取30 min。

色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（60.0 m×0.25 mm× 0.25 μm）；进样口温度250℃；分流比20∶1；程序升温：50℃保持2min，10℃/min升至230℃，保持15min；载气：99.999%氦气，载气流速：2 mL/min。

质谱条件：电离电压70 eV；离子源温度220℃；四极杆温度为150℃；电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；质量扫描范围为50～500 amu；溶剂延迟3 min。

定性定量分析：质谱图通过与美国Agilent公司提供的标准普库（NIST05a.L）比对，选择匹配度均＞800（最大值为1 000）、特征离子进行定性分析。并采用面积归一化法进行定量分析，根据某一物质的色谱峰面积与总峰面积的比值求出其相对含量。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选与鉴定

2.1.1 菌株的分离纯化

从高温大曲样品中筛选得到18株菌，通过产吡嗪试验，发现3株菌经发酵能产生吡嗪类物质，编号为B1、B2、B3。对分离出的3株细菌进行革兰氏染色和镜检试验，结果见图1。

图1 分离菌株的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of isolated strains

由图1可知，3株细菌均为革兰氏阳性菌。菌株B1菌落呈白色，光滑，湿润，正面和反面，中心和边缘颜色一样，易于挑取，无粘性；菌株B2菌落不透明，略带米白色，边缘较光滑，有粘性，不易挑起；菌株B3菌落呈鹅黄色，菌落中间颜色较浅，边缘颜色较白，较光滑，易于挑取，生长前期较短，后期菌体比前期长，粗细较均匀。

2.1.2 MIDI微生物鉴定系统鉴定结果

根据MIDI操作手册，当鉴定结果第一选择的相似指数（similarity index，SI）＞0.500，且第一选择和第二选择的SI差值＞0.100，则可以认为鉴定成功，鉴定结果为第一选择所列的菌种名。通过皂化、甲基化、萃取、碱洗涤等过程，提取出3菌株的PLFA，运用MIDI微生物鉴定系统进行了菌种鉴定，结果见表1。由表1可知，分离出的菌株为2种不同的芽孢杆菌，菌株B1为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。蜡状芽孢杆菌在医药方面具有广泛的应用价值，可以用于人类胃肠道疾病的防治、降血脂、抗衰老、防止细菌移位、抗肿瘤及自身免疫性疾病防治等[17]；萎缩芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的黑色变种，枯草芽孢杆菌是酱香风味和芝麻香风味的重要生产菌[18]。

表1 MIDI微生物鉴定系统鉴定结果Table 1 Identification results of MIDI microbial identification system

2.2 发酵产物分析

2.2.1 液态发酵结果分析

表2 液态发酵结果分析Table 2 Results analysis of liquid fermentation

对3株芽孢杆菌进行纯培养，并利用固相微萃取-气相色谱-质谱分析（SPME-GC-MS）对菌株B1、B2和B3液态发酵液中吡嗪类物质含量测定，结果见表2。由表2可知，发酵液含有不同种类的吡嗪类物质。菌株B2、B3发酵液中含有较多的吡嗪类物质，相对含量分别67.459%和80.455%，其中以2,6-二甲基吡嗪为主，相对含量分别达54.669%和71.127%；菌株B1发酵液中吡嗪类物质相对含量较低，仅为24.455%。结果表明，作为枯草芽孢杆菌的变种，萎缩芽孢杆菌也有较强的吡嗪生产能力。

2.2.2 固态发酵结果分析

对菌株B1、B2和B3进行固态纯培养，利用SPME-GC-MS对样品中吡嗪类物质的含量测定，固态发酵结果成分分析图见表3。试验发现，3个发酵样品中均含有3-羟基-2-丁酮，研究表明，3-羟基-2-丁酮对白酒风味的形成起到非常重要的作用，它是生成吡嗪类化合物的前体物质，与其他代谢产物共同作用于白酒特征风味物质的形成，特别是为酱香型白酒特征风味成分的形成奠定了基础。其中菌株B2样品中的吡嗪前体物质含量最高，达到85.914%；B1和B3号菌株中吡嗪前体物质含量分别达84.669%和77.344%。

表3 固态发酵结果分析Table 3 Results analysis of solid fermentation

3 结论

本试验从高温大曲中筛选出了产吡嗪芽孢杆菌，并对其进行形态学和PLFA鉴定。结果表明，共筛选出的3株产吡嗪菌株，菌株B1被鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus），菌株B2和B3被鉴定为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。对三株菌进行固态和液态发酵代谢产物分析，发现在液态发酵条件下3株菌发酵均产吡嗪类化合物，其中菌株B2和B3产吡嗪类化合物相对含量较高，均＞60%；在固态发酵条件下，三株菌均产生吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮，相对含量均＞75%，表明所筛菌株均有较高的吡嗪物质产生能力，能对酱香型白酒风味起积极的作用。

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Isolation and identification of pyrazine-producingBacillusfrom high-temperature Daqu and analysis of its fermentation products

WANG Wenpeng,LI Yongbo,WU Shukun,LIU Mei,DENG Jie,WEI Chunhui,HUANG Zhiguo*
(Sichuan Provincial Key Lab of Liquor-marking Biotech＆Application,School of Bioengineering,Sichuan University of Science& Engineering,Zigong 643000,China)

The pyrazine-producingBacilluswas screened from high-temperature Daqu and identified by morphologic observation and phospholipid fatty acid(PLFA)analysis.Its metabolites were analyzed by fermentation tests.Three strains ofBacilluswere screened and named B1,B2and B3, respectively.The strain B1wasBacillus cereus,strains B2and B3wereBacillus atrophaeus.The results of fermentation products analysis of three strains showed that the threeBacilluscould produce pyrazine under the conditions of liquid fermentation,and the pyrazine relative content in strains B2and B3fermentation products were high(more than 60%).The pyrazine precursor substance 3-hydroxy-2-butanone were produced under the conditions of solid fermentation,and relative content were more than 75%in the fermented products,which indicated the three strainsBacillushad a certain effect on flavor substances production in Moutai-flavorBaijiu.

high-temperature Daqu;Bacillus;pyrazine

TS261.1

0254-5071（2017）06-0063-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.013

2017-01-05

国家固态酿造工程技术研究中心开放基金项目（2015K-246）；酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开放基金项目（NJ2014-16）；四川省科技成果转化项目（2016CC0032）；四川理工学院人才引进项目（2014RC28）

汪文鹏（1993-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：黄治国（1978-），男，教授，博士，研究方向为发酵工程。