响应面法优化甲基营养型芽孢杆菌J2B-74代谢产细菌素的发酵条件

王松，游玲，陈杰，邓小娅，王涛

（1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾644000）

响应面法优化甲基营养型芽孢杆菌J2B-74代谢产细菌素的发酵条件

王松1，2，游玲1，2，陈杰1，邓小娅1，王涛1，2

（1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾644000）

为提高一株分离自浓香型白酒糟培的菌株甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）J2B-74发酵产细菌素能力，以金黄色葡萄球菌为指示菌，以抑菌圈直径为考察指标，在单因素试验的基础上采用响应面法优化发酵工艺。结果表明：最优发酵条件为发酵起始pH 6.0、发酵时间33.5 h、发酵温度36.5℃，接种量1%，吐温-80添加量5‰。在此条件下平均抑菌圈直径为14.07 mm，较优化前提高了32.36%。最优发酵条件下获得的实验结果与模型预测值吻合，说明所建立的模型是切实可行的。

甲基营养型芽孢杆菌细菌素；发酵条件；响应面法；优化

浓香型白酒生产是一种固态的半自然发酵过程，发酵依赖于生产环境、曲药、窖泥内众多微生物的协同参与。宜宾是中国浓香型白酒的重要产区，近千年的酿酒历史、适宜的生态因子、相对特殊的酿酒工艺使其整个酿酒微生物区系存在相当的特殊性。研究团队多年来一直开展宜宾浓香型白酒酿酒微生物资源的系统研究[1-3]，其中从浓香型白酒发酵糟培分离到1株细菌产抑菌物质的能力较好，经验证后确定该抑菌物质为细菌素，且热、酸稳定性好，抑菌谱范围广，尤其对革兰氏阳性菌抑制能力强。

细菌素的合成和分泌是受到严格调控的，细菌素生产一般与菌体生长同步，且随着细菌数量的增多而增加分泌，菌体生长后期细菌素活性和数量又有所下降[4]。培养条件是菌体生长和细菌素合成的重要因素，培养条件的优化对于细菌素产量的提高有非常重要的影响[5]。本研究以宜宾浓香型白酒糟培中分离得到的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）J2B-74为研究对象，通过单因素试验和响应面法优化发酵条件，探讨该菌代谢产生细菌素的最优发酵参数，以期为进一步深入研究，扩大菌种资源的利用奠定基础[6-10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

产细菌素菌株甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）J2B-74：分离自宜宾浓香型白酒厂酒糟，由固态发酵资源与利用四川省重点实验室提供；指示菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）ATCC 6538：中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。

改良营养琼脂（nutrient agar，NA）液/固体培养基：取100g出窖酒糟，加500mL蒸馏水，室温充分搅拌混匀，115℃灭菌30 min后无菌纱布过滤，配制培养基定容至1 000 mL。1.2仪器与设备

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉（均为生化试剂）：西陇化工股份有限公司；MJ-Ⅱ微生物培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；Eppendorf AG 5810冷冻离心机；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞发酵上清液的制备

按1%的接种量将BacillusmethylotrophicusJ2B-74接种至装有200mLNA液体培养基的500mL三角瓶中，发酵起始pH6.5，发酵温度37℃，摇床转速120 r/min，发酵时间24 h，结束发酵。发酵液在6℃、8 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液，用5 mol/LNaOH调pH 6.5以中和有机酸的干扰，经0.22 μm滤膜过滤除去菌体及其他杂质，现制现用[11]。同时以未接种的NA液体培养基，经同样处理后作为空白对照。

1.3.2 抑菌活性测定（滤纸片扩散法）

该试验通过抑菌圈大小反应细菌素产量。在直径90mm无菌培养皿中接入指示菌种子液100 μL涂布均匀，均匀放置直径为6 mm无菌纸片3个，加入25 μL无细胞发酵上清液于纸片上；将培养皿放置在恒温培养箱中37℃培养24 h，观察测量包括纸片在内的透明圈直径，3组平行测量后取平均值[12]。

1.3.3 单因素试验

（1）接种量的影响

分别以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的接种量接种J2B-74，发酵起始pH为6.0、培养温度37℃，培养时间24 h，结束发酵，取样并测定发酵上清液的抑菌活性。

（2）发酵温度的影响

按1.0%的接种量接种菌株J2B-74，发酵起始pH 6.0，分别置于28℃、31℃、34℃、37℃、40℃培养温度下，培养时间24 h，结束发酵，取样并测定发酵上清液的抑菌活性。

（3）发酵起始pH值的影响

按1.0%的接种量接种菌株J2B-74，分别设置发酵起始pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培养温度37℃，培养时间24 h，结束发酵，取样并测定发酵上清液的抑菌活性。

（4）吐温-80的影响

按1.0%的接种量接种菌株J2B-74，分别添加0、1%、2%、3%、4%、5%、6%的吐温-80，初始培养pH6.0，培养温度37℃，培养时间24 h，结束发酵，取样并测定发酵上清液的抑菌活性[13]。

（5）培养时间的影响

按1%的接种量接种菌株J2B-74，发酵起始pH值为6.0，培养温度37℃，每隔3 h取样，至42 h结束，测定发酵上清液的抑菌活性，并采用分光光度计在波长600 nm条件下测定不同培养时间菌株J2B-74菌悬液的浓度，绘制生长曲线。

1.3.4 响应面优化

以单因素试验优化结果为基础，选取发酵起始pH值（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）3个影响较为显著的因素为自变量，以抑菌圈直径为响应值，进行中心组合试验设计。每个试验重复3次，每次做3个平行，取平均值，试验因素及编码水平见表1。将试验后的数据进行多元回归拟合，并对回归方程进行方差分析及拟合度检验。

表1 中心组合试验因素及编码水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.3.5 模型的验证

通过响应面法优化Bacillus methylotrophicusJ2B-74代谢产抑菌物质的发酵条件；在优化条件下进行发酵试验，通过比较预测值和试验值验证模型的有效性。

1.3.6 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010统计软件进行单因素方差分析和差异显著性分析，采用Design Expert8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 接种量的影响

接种量对菌株J2B-74产抑菌物质的影响见图1。由图1可知，当接种量≥1.0%时，方差分析结果显示不同接种量对该抑菌圈直径影响并不显著（P＞0.05），细菌素是由细菌通过核糖体合成的微生物初级产物，细菌素的产量与菌体生长情况密切相关[14]，虽然本试验最开始采用了不同的接种量，但是在发酵24 h后，各处理菌体数量基本一致，说明细菌素的代谢合成量也应该差异不大。因此固定接种量条件为1.0%，并不作为后期响应面优化试验的考察因素。

图1 接种量对菌株J2B-74抑菌效果的影响Fig.1 Effect of inoculum on bacteriocin production of strain J2B-74

2.1.2 发酵温度的影响

发酵温度对菌株J2B-74产抑菌物质的影响见图2。如图2所示，28℃时菌体生长受到强烈抑制，生长缓慢，抑菌圈直径很小，在28～34℃区间内随着温度升高，菌体生长速度加快，抑菌圈直径上升趋势明显；当发酵温度为37℃时，抑菌圈直径达到最大，为11.14 mm，同时在34～37℃温度范围内，菌体生长良好，抑菌圈直径较大；而当发酵温度为40℃时，抑菌圈直径显著下降，菌体生长也受到明显抑制。发酵温度对细菌自身的生长和菌体的合成代谢及其产物都有很大的影响，不同细菌产细菌素的最适培养温度差异较大，同时很多研究表明，菌株产细菌素的最适温度与菌株生长最适温度存在明显偏差，通常在低于菌体最适生长温度的条件下细菌素的产量更高[15]，但从结果看本实验菌株产细菌素最适温度与菌株最适生长温度差异不显著，推测可能是菌株长期处于窖池内的复杂环境体系，压力、氧气、酸、醇等环境因素促使其生长时尽快产生细菌素，帮助菌株适应其竞争环境。选择发酵温度37℃作为响应面的中心点。

图2 发酵温度对菌株J2B-74抑菌效果的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production of strain J2B-74

2.1.3 发酵起始pH的影响

图3 培养基起始pH对菌株J2B-74抑菌效果的影响Fig.3 Effect of initial pH on bacteriocin production of strain J2B-74

发酵初始pH对菌株J2B-74产抑菌物质的影响见图3。由图3可知，发酵起始pH对Bacillus methylotrophicusJ2B-74产细菌素影响较大，在初始pH为4.5～8.5范围内，随着pH增大，细菌素产量呈现先增加后减少的趋势，在初始pH为 6.0的时候抑菌圈直径达到最大，直径为11.29 mm。过酸或偏碱性条件抑制该菌的生长，也相应抑制细菌素的产生；同时本实验菌种分离至浓香型白酒酿造糟培，在长期生产实践过程中逐渐适应糟培偏酸性环境，能够在中性偏酸的环境下较好的生长，从而有利于细菌素的产生，因此选择起始pH为6.0作为响应面的中心点。

2.1.4 J2B-74生长曲线及发酵时间的影响

菌株J2B-74的生长曲线与不同时间条件下的产抑菌物质见图4。由图4可知，0～6 h为适应期，菌体生长量和细菌素产量几乎为0；6～21 h为对数生长期，在此期间抑菌圈直径随时间缓慢增大；发酵21 h后菌体数量达到最大值，细菌素开始快速积累，抑菌圈直径随发酵时间增长而快速增长，在33 h时达到最大值；之后菌体生长进入衰亡期，抑菌活性开始减弱，抑菌圈直径快速降低。

图4 菌株J2B-74生长曲线与其抑菌效果Fig.4 Growth curve of strain J2B-74 and bacteriocin production of strain J2B-74

细菌素是细菌用于调控菌群结构的一种有效方式，一般都是在菌体增殖到一定数量后才开始分泌并一直延续到平台期[16]。菌株J2B-74进入对数生长期后，细胞数量急剧增加，当胞外信息素的浓度达到一个阈值时，细菌素的合成和分泌开始启动[17]；当菌体数量达到最大值时（21 h），生存空间和营养素开始出现不足，这时菌体产生大量细菌素来适应环境，从而获得更多的养料与生存空间来维持自身的生存。进入衰亡期后（33 h），随着菌体大量死亡，细菌素产量下降；同时一部分菌体自溶，大量的蛋白酶类释放出来，细菌素被大量降解，导致抑菌圈直径急速减小。因此选择33 h作为菌株产细菌素的最佳培养时间，并以此时间为响应面分析因素的中心点。

2.1.5 吐温-80对抑菌活性的影响

吐温-80对菌株J2B-74产抑菌物质的影响见图5。由图5可知，吐温80对产细菌素影响不显著，即使吐温添加量为0，细菌素产量仍然可达到一个较高的水平，但添加吐温-80后抑菌圈直径普遍增大，当添加量为5‰时达最大，直径为11.61 mm，继续添加抑菌圈直径反而降低。细菌素合成后需要释放到周围环境中去才能实现菌群调控的作用，吐温-80作为一种乳化剂，可以改善微生物细胞膜的通透性，促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外，进而促进细菌素的产生和活力的增强。但过量的吐温-80会影响细菌素的合成和纯化，因此选择5‰为吐温-80的最适添加量[18]。

图5 吐温-80对菌株J2B-74产抑菌物质的影响Fig.5 Effect of Tween-80 on bacteriocin production of strain J2B-74

2.2 响应面分析

2.2.1 回归模型的建立

中心组合试验方案及结果见表2。采用中心组合试验设计，用Design Expert 8.06软件对表中数据进行多元回归拟合，得到回归方程为：

表2 中心组合试验方案及结果Table 2 Design and results of central composite tests

2.2.2 回归模型方差分析

对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，回归模型的P＜0.000 1，失拟项的P=0.140 3，模型回归极显著（P＜0.01），失拟检验不显著，说明未知因素对试验结果干扰很小，模型适当。同时，该模型的决定系数为0.992 9，说明该方程与实际情况拟合很好，可用该模型对Bacillus methylotrophicusJ2B-74代谢产细菌素的培养条件进行分析和预测。模型中一次项X3极显著（P＜0.01），X2显著（P＜0.05），X1不显著（P＞0.05）；二次项X12、X22、X32均为极显著水平（P＜0.01）；交互项X1X2、X1X2、X1X2均不显著（P＞0.05）。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.2.3 响应曲面图及验证试验

根据回归方程，采用Design Expert 8.06软件对该模型绘制响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，不同因素交互作用对菌株抑菌圈直径的影响见图6。

图6分别反映了发酵培养基的初始pH和发酵时间，起始pH和发酵温度，发酵时间和温度之间的影响和关系。通过多项回归方程可知，二次项的系数均为负值，表明该曲面图的开口向下，因此存在极大值点，即菌株J2B-74无菌发酵液相对抑菌圈最大时的最佳发酵条件。由软件分析所得最佳发酵条件为起始pH5.99，发酵时间33.53 h，发酵温度36.52℃。在此条件下抑菌圈直径为14.13 mm。

考虑试验结果的可操作性，调整培养条件为：起始pH6.0、发酵时间33.5 h、发酵温度36.5℃。为验证响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行3次平行试验，实际测得的平均抑菌圈直径为14.07 mm，与预测值拟合率达99.31%，证明应用响应曲面优化菌株J2B-74产细菌素的发酵条件是可行的。优化后的抑菌圈直径比优化前（10.63 mm）提升了32.36%，说明本试验所确定的优化方案的设计合理有效，所获得的培养条件能够明显提高细菌素的产量。

图6 起始pH、发酵温度和发酵时间交互作用对抑菌圈直径的影响Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,fermentation temperature and time on inhibition zone diameters

3 结论

在单因素试验的基础上，利用响应面法对Bacillus methylotrophicusJ2B-74代谢产细菌素的发酵条件进行了优化，建立了抑菌圈直径与培养基起始pH、发酵温度、发酵时间3个因素的二次多项式回归模型，验证试验证明该模型合理可靠，并确定Bacillus methylotrophicusJ2B-74代谢产细菌素的最佳培养条件为发酵起始pH为6.0、发酵时间33.5 h、发酵温度36.5℃。在此条件下抑菌圈直径可达14.07 mm，较优化前提高了32.36%。

[1]游玲，任羽，王涛，等.酵母对浓香型白酒糟醅中高级醇生成的影响[J].食品与发酵工业，2016，42（2）：23-28.

[2]王涛，田时平，赵东，等.宜宾浓香型白酒窖泥中细菌的系统发育多样性[J].食品与发酵工业，2011，37（10）：12-18.

[3]冯瑞章，庞建义，王涛，等.浓香型白酒产糖化酶菌株筛选及产酶条件研究[J].中国酿造，2013，32（10）：81-84.

[4]吴清平，黄静敏，张菊梅，等.细菌素的合成与作用机制[J].微生物学通报，2010，37（10）：1519-1524.

[5]刘宝生，张锦华，罗军荣.细菌素及其应用的研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40（5）：123-128.

[6]向军，张金虎，柴海云，等.甲基营养型芽孢杆菌产氨肽酶的发酵优化[J].中国酿造，2012，31（5）：45-50.

[7]刘国荣，张郡莹，王成涛，等.响应面法优化双歧杆菌B04代谢产抑菌物质的发酵条件[J].食品科学，2013，34（3）：147-152.

[8]王辉，贡汉生，孟祥晨.一株短乳杆菌所产细菌素的部分特性[J].微生物学通报，2011，38（7）：1036-1042.

[9]乌云达来，陆兆新，吕凤霞，等.嗜酸乳杆菌NX2-6产细菌素的发酵条件优化[J].食品科学，2012，33（3）：179-183.

[10]胡青平，张红，周冰，等.响应面法优化光合细菌PSB-B的生长条件[J].食品工业科技，2013，34（15）：230-233.

[11]尚楠，王洋，任发政，等.产细菌素双歧杆菌的筛选及其分泌条件研究[J].食品科学，2013，34（23）：170-175.

[12]侯亚文，易华西，杨艳艳，等.产细菌素乳酸菌筛选方法的研究进展[J].食品与发酵工业，2013，39（3）：129-133.

[13]WOLF C E,GIBBONS W R.Improved method for quantification of the bacteriocin nisin[J].J Appl Bacteriol,1996,80(4):453-457.

[14]胡敏，郝林，贾丽艳.枯草芽孢杆菌产细菌素发酵条件的优化[J].食品科学，2014，35（9）：198-202.

[15]陈琳，孟祥晨.响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件[J].食品科学，2011，32（3）：176-180.

[16]满丽莉，孟祥晨，王辉，等.群体感应系统在乳酸菌产细菌素中的作用[J].食品科学，2011，32（13）：360-364.

[17]KELLER L,SURETTE M G.Communication in bacteria:an ecological and evolutionary perspective[J].Nat Rev Microbiol,2006,4(10):249-258.

[18]李景良，宋达峰，顾青.植物乳杆菌ZJ316生产细菌素[J].微生物学报，2008，48（6）：818-823.欢迎登录《中国酿造》网站www.chinabrewing.net.cn欢迎投稿

Optimization of fermentation conditions ofBacillus methylotrophicusJ2B-74 for bacteriocin production by response surface methodology

WANG Song1,2,YOU Ling1,2,CHEN Jie1,DENG Xiaoya1,WANG Tao1,2
(1.College of Life Science and Food Engineering,Yibin University,Yibin 644000,China; 2.Key Laboratory of Sichuan Province for the Utilization of Solid State Fermentation Resources,Yibin University,Yibin 644000,China)

The fermentation conditions ofBacillus methylotrophicusJ2B-74,isolated from Luzhou-flavorBaijiuZaopei,were optimized for bacteriocin production.Staphylococcus aureuswas used as indicator bacterium and inhibition zone diameter was used as evaluation index of antibacterial activity.Based on the single factor tests,the optimal fermentation conditions for antibacterial components production were explored by response surface methodology.Results indicated that the optimal fermentation conditions were initial pH 6.0,fermentation time 33.5 h,temperature 36.5℃,inoculum 1%,and Tween-80 5‰.Under the optimal conditions,the inhibition zone diameter was 14.07 mm,which was 32.36%higher than that before optimization.Therefore,it is feasible for the established model due to the consistent results between the prediction and experimental value.

Bacillus methylotrophicusbacteriocin;fermentation conditions;response surface methodology;optimization

TS262.3

0254-5071（2017）06-0042-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.009

2016-12-24

四川省科技厅支撑计划项目(15ZC0141)；香源生物及产香生物技术四川高校科研创新团队建设计划资助（14TD0031）

王松（1982-），男，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术及副产物利用。