ISSR分子标记技术在园林植物中的应用

张兆祥

摘要：主要从遗传多樣性研究、亲缘关系与分类学研究和种质资源鉴定研究3个方面介绍了ISSR分子标记在园林植物中的应用，并探讨其存在的问题。

关键词：ISSR；遗传多样性；亲缘关系；植物分类学；种质资源；园林植物

0前言

简单重复序列（inter-simple sequence repeat），即ISSR DNA分子标记技术是一种根据广泛存在于植物中的微卫星序列，在其3端或5端上各加2～4个非重复随机核苷酸序列做为引物，引起特定位点退火并对重复序列间的DNA片段进行PRC扩增的第2代分子标记技术。相对于第1代分子标记技术，ISSR标记技术具有以下优点：模版DNA用量较小；引物设计简单，成本低；PCR扩增产物具有良好的稳定性和丰富的多态性；产物重复性好；实验的安全性较高以及技术难度性较低等。由于ISSR分子标记技术具有以上特点，现已在遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育等研究方面被广泛应用。本文就其中几个方面谈谈这种新型标记技术在园林植物中的应用。

1ISSR标记技术在园林植物中的应用

1.1园林植物遗传多样性研究

遗传多样性本质为生物体遗传物质上的变异，是探讨植物适应能力和生存能力的基础，也是研究植物致濒机理的基础，大量实验证明，物种遗传变异大小与它进化速度成正比，一个种群的遗传多样性越低，适应环境的能力也越低，就无法在相对恶劣的环境中生存下去，最终导致灭绝。

Lu00等对杜鹃山茶花进行遗传多样性分析，10条引物对2个亚种群的60个单株共扩增出85个条带，多态性条带47个，多态位点百分率55.29%，Nei多样性指数0.2196，Shannon多样性指数0.3215，种群间遗传分化系数0.0922，表明杜鹃山茶花较低的遗传多样性，并分析该现象的原因与人为活动影响有关。李单琦在福建柏研究中表明，福建柏种群间和种群内均具有较高的遗传多样性，7个种群总体观测等位基因数Na为1.8218，有效等位基因数Ne为1.4313，Nei遗传多样性指数h为0.2582，Shannon信息指数I为0.3940；种群内Na指数平均为1.3720，Ne指数平均为1.2892，Nei指数平均为0.1600，Shannon指数平均为0.2035。由此推论，导致福建柏濒危并非由于遗传多样性的缺乏，而是人为对其生长环境的破坏导致其居群规模不断减小，生境片段化，使种群间基因交流减少，增加了近交和遗传漂变作用。

1.2园林植物亲缘关系与分类学研究

植物生长过程中由于混合花杂交选种或实生选种，会有许多自然杂种的存在，因而具有比较复杂的遗传背景，传统的几大标记方法（形态标记、生化标记、细胞标记）在对植物进行分类研究时，均存在一定的缺陷，不具备较强的说服力，而从DNA层面进行研究的ISSR标记技术可以很好地解决这一问题。

李雪萍等对我国的珍稀濒危植物洪桐的6个天然居群与2个人工居群共计229份样品进行ISSR分析，证明该洪桐居群缺乏有效基因交流，其中湖北长阳陈祥湾与星斗山保护区（洪桐湾）的遗传相似度最小为0.8484，说明两者亲缘关系最近，而湖北长阳陈祥湾与星斗山保护区（长湾）的遗传相似度最大为0.9278，说明其亲缘关系最远，通过UPGMA方法对居群间Nei指数进行分析得出洪桐居群间的遗传分化与地理距离没有直接相关性。莫文娟对泡桐属植物的亲缘关系进行研究，采用UPGMA法将研究材料分成毛泡桐组、白花泡桐组和川泡桐组3大组，地理分布较近的种质聚类在一起，表现出较密切的亲缘关系；在对兰考泡桐、山明泡桐、白花兰考泡桐、楸叶泡桐、圆冠泡桐、亮叶毛泡桐、毛泡桐、白花泡桐、川泡桐的亲缘关系分析及分类处理上，基本上与形态学、细胞学、同工酶的研究结果一致。

1.3园林植物种质资源鉴定研究

园林植物种质鉴定有物种间、种群内、种群间不同品种、不同地理群的鉴定及杂交种、亲子鉴定等。物种间基因组差异大，容易鉴定，通过形态和多种标记易区分；物种内不同种属、不同地理群体或杂交品系的鉴定区分比较复杂，在形态上无法辨别，需要寻找品种特异性或地理群体特异性的标记。在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记，某一品种具有区别于其它品种的独特标记，即一些特异性DNA片段的组合就称为该品种的“指纹”。各品种独特的指纹片段构成该物种DNA指纹库。

李单琦运用ISSR分子标记技术，通过对17个引物扩增结果进行仔细筛选比较得出，引物UBC849可以将供试的24份福建柏样本完全鉴别出来，表现出较好的鉴别能力，并基于此结果形成特有的福建柏分子身份证编码，为福建柏构建一个基于ISSR分析的DNA指纹图谱；邱英雄等利用ISSR分子标记技术对杨梅的7个基本品种和2个优良无性系遗传多态性和遗传关系进行研究，用筛选出的分辨率高和重复性最好的引物构建了这些优质园林树木品种的标准DNA电泳图谱，使园林树木品种或类型鉴定更准确、快捷；邱英雄等人还对6种类型的乐昌含笑进行鉴定，只需要2种引物即可区分出全部类型；缪恒彬等选用21个ISSR引物对新选育的25个小菊品种进行扩增，并建立了其ISSR指纹图谱，其中一条引物ISSR 35可将25个品种完全区分开。

2问题与展望

综上所述，ISSR分子标记作为一种新型分子标记技术，在园林植物的遗传多样性研究、亲缘关系及分类学研究和种质资源鉴定等方面已取得了较大进展与广泛的应用。但与其它农作物、果树等经济植物相比，ISSR应用于园林植物研究起步晚，基础差，仍然存在不足，比如ISSR大部分为显性标记，不能区分纯合体与杂合体，因此进行两倍体或多倍体物种的种群多样性研究时，还没有一种合适的数学模型来进行数据分析。现如今，随着人们生活水平的渐渐提高，城市的园林绿化越来越受到重视，同时人们对园林植物的重要性有了更加深刻的认识。相信随着分子生物学和生物信息学技术的不断发展和改进，ISSR分子标记技术凭借其简便、经济、快速、多态性高、稳定性强等优点将越来越得到广泛使用，特别是应用于大批量样品的研究，对园林植物种质资源研究发挥更大的作用。

（收稿：2016-08-25）