HPLC—MS法测定饮料中甜蜜素等6种非糖类甜味剂含量

张倩勉 盘正华 范兴 邓玉秀 庞贞武

摘要 [目的]建立快速、准确、高灵敏度的测定甜蜜素等6种甜味剂的分析方法。[方法]采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）测定市售饮料中的甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷的含量，同时采用正负离子模式，并进行多反应检测（MRM）。[结果]该方法的线性范围为20～1 000 ng/mL，标准曲线线性良好，其回归方程及相关系数R分别为：甜蜜素，Y=3 380X-49 100，R=0.999 7；安赛蜜，Y=8 620X+21 700，R=0.998 7；阿斯巴甜，Y=4 070X-12 400，R=0.999 7；纽甜，Y=5 930X-21 300，R=0999 4；三氯蔗糖，Y=123X+425，R=0.999 7；甜菊糖苷，Y=332X-967，R=0.997 1。最低检出限分别为甜蜜素0.1 mg/kg、安塞蜜0.2 mg/kg、阿斯巴甜0.2 mg/kg、纽甜0.03 mg/kg、三氯蔗糖0.2 mg/kg、甜菊糖苷0.2 mg/kg。[结论]该方法操作简便、快速，是食品中甜蜜素等6种非糖类甜味剂的快速而准确的检测方法。

关键词 高效液相色谱-串联质谱法；饮料；甜味剂；含量；测定

中图分类号 TS202.3 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2017）13-0099-04

Determination of Cyclamate Sodium etc.Six Kinds of Sweetening Agent of Non-carbohydrate in the Drinks by HPLC-MS

ZHANG Qian-mian1，PAN Zheng-hua1，FAN Xing1，PANG Zhen-wu2* et al （1.Guangxi and Asean Inspection Testing Center for Food and Drug Safety，Nanning，Guangxi 530021； 2.Guangxi Bagui Forest Tree Seedlings Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 53002）

Abstract [Objective] In order to establish a rapid，accurate，high sensitivity method for determination of Cyclamate Sodium etc.six kinds of sweetening agent.[Method] The contents of Cyclamate Sodium，Acesulfame，Aspartame，Neotame，Sucralose and Stevioside in commercially available beverage were determined by HPLC-MS，the positive and negative ion modes were used to conduct MRM.[Result] The results showed that a good linearity was obtained for the standard curve with 20 to 1 000 ng/mL，and the regression equation and correlation coefficient R were：Cyclamate Sodium：Y=3 380X-49 100，R=0.999 7； Acesulfame Y=8 620X+21 700，R=0.998 7； Aspartame：Y=4 070X-12 400，R=0.999 7； Neotame：Y=5 930X-21 300，R=0.999 4； Sucralose：Y=123X+425，R=0.999 7； Stevioside：Y=332X-967，R=0.997 1.The minimum detection limits were：Cyclamate Sodium：0.1 mg/kg； Acesulfame ：0.2 mg/kg； Aspartame：0.2 mg/kg； Neotame：0.03 mg/kg； Sucralose：0.2 mg/kg；Stevioside：0.2 mg/kg.[Conclusion] This method is rapid，simple，sensitive and accurate，and it is a suitable method for rapid determination of Cyclamate Sodium etc.six kinds of sweetening agent of non-carbohydrate in the food.

Key words HPLC-MS；Drink；Sweetening agent；Content；Determination

非糖类甜味剂包括天然甜味剂和人工合成甜味剂，一般甜度很高，用量极少，热值很小，有些又不参与代谢过程，常称为非营养性或低热值甜味剂，是甜味剂的重要品种。天然甜味剂的主要产品有甜菊糖苷、甘草甜素、竹芋甜素等。人工合成甜味剂的主要产品有糖精、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、纽甜、新橘皮苷二氢查耳酮等。

甜蜜素又名环己基氨基磺酸钠，是一种人工合成的低热值新型甜味剂，可代替蔗糖，或与其他甜味剂复配使用。甜蜜素已被广泛应用于食品加工业、制药业、农业等领域。1969年美国科学家有试验表明它可导致白鼠膀胱肿瘤的发生，从而使美国、英国、法国等许多国家和地区开始禁止在食品中使用甜蜜素[1] 。在我国，GB 2060—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[2]中对甜蜜素的添加量有明确规定。

安赛蜜又称为乙酸磺胺酸钾、AK糖，1983年首次在英国得到批准应用，适用于焙烤食品和酸性饮料[3]。1992年，我国批准安赛蜜可用于饮料、冰淇淋、糕点、蜜饯等。

三氯蔗糖（TGS）是由英国泰莱公司（Tate&Lyie）与伦敦大学共同研制并于1976年申请专利的一种新型甜味剂。这是目前唯一一种以蔗糖为原料的功能性甜味剂[4-5]。三氯蔗糖具有在人体内不参与代谢、不被人体吸收、热量为零等特性[6-7]；同时动物研究表明，终生或长期食用三氯蔗糖也很安全；在普通人类志愿者身上进行的长期试验表明，三氯蔗糖不会对人类健康产生不可逆作用[8-9]。因此，三氯蔗糖被广泛应用在饮料、面包、果酱、糕点、果冻、布丁等食品加工中。

阿斯巴甜化学名称为L-天冬氨酞- L- 苯丙氨酸甲酯（APM），又称甜味素。目前，该甜味剂已经在100个国家及多个权威机构得到认可，我国于1986年正式批准其在食品中使用。目前，阿斯巴甜已经发展成为国际市场上的主导强力甜味剂。阿斯巴甜的优点是安全性高、甜味纯正[10-11]，与蔗糖或其他甜味剂混合使用有协同增效作用等[12]。

纽甜是一种人工糖精和功能性甜味剂，是目前最甜的甜味剂[13]，其在食品中的使用量根据食品的类别，在GB 2760—2014中有明确的规定[2]，但纽甜在单独使用时无论在口感和风味方面均与蔗糖有一定的差异， 并因其甜度大体积小， 以等甜度浓度完全替代蔗糖用于固体或半固体食品时，有时会引起产品质构、黏度和体积方面发生明显变化而影响产品的感官指标[14]。为了得到口感和风味类似于蔗糖的增甜效果，生产中常将纽甜与其他甜味剂复配使用。

甜菊糖苷是一种低热量、高甜度的天然甜味剂，化学结构稳定、安全低毒、甜味高、热值低、甜味纯正，味道近似白糖，可以取代蔗糖或其他甜味剂应用在食品以及工业生产中，也是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂。因此经常用于制作糖果、饮料、油炸小食品、调味品等产品[15-19]。用甜菊糖作为糖替代品用在加工食品以及饮料中，不仅可以降低成本，还符合食品和饮料低糖化的发展趋势。

目前，非糖类甜味剂中每一种成分其检测方法均不同，耗时较长。为了简化检验操作步骤，提高效率，笔者主要用高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）同时检测饮料中甜蜜素等6种非糖类甜味剂的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与主要试剂。饮料，市购；甜蜜素（含量998%）、安赛蜜（含量99.9%），Supelco公司；阿斯巴甜（含量97.2%）、三氯蔗糖（含量99.0%），DR.Ehrenstorfer Gmbh；甜菊糖苷（含量98.0%）、纽甜（含量98.0%），安普；乙酸、甲醇均为色谱纯；水为超纯水。

1.1.2 仪器设备。 Agilent-1260高效液相色谱-4500 QTRAP质谱仪，美国AB公司；XSE205DU分析天平。

1.2 方法

1.2.1 对照品储备液。

准确称取甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、甜菊糖苷6种对照品，分别置6个10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，摇匀，即得甜蜜素等6种对照品储备液，浓度分别为1.209 6、1.172 8、1.327 8、1.096 9、1.027 0、1.045 7 mg/mL。

1.2.2 混合对照品工作液。

精密吸取甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜对照品储备液各0.1 mL，精密吸取三氯蔗糖、甜菊糖苷对照品储备液各0.2 mL，置同一50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀（浓度分别为甜蜜素2.419 μg/mL、安赛蜜2.346 μg/mL、阿斯巴甜2.656 μg/mL、三氯蔗糖4.388 μg/mL、纽甜2.054 μg/mL、甜菊糖苷4.183 μg/mL）。

1.2.3 标准曲线。

分別吸取上述6种混合对照品工作液0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.50 mL，分别置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得各对照品的标准曲线。

1.2.4 色谱条件。色谱柱：Agilent SB -aq（4.6 mm×1000 mm，2.7 μm）；流动相组成： A相为甲醇，B相为0.1%乙酸水溶液；流速0.70 mL/min；柱温为室温；进样量5 μL。梯度洗脱，洗脱程序见表1。

1.2.5 质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI源）。扫描方式：正离负子同时扫描。检测方式：多反应监测（MRM）。

扫描模式：①负离子模式。气帘气：241.32 kPa；离子喷雾电压：-4 500 V；温度：550 ℃；喷雾电压：-80 V；入口电压：-10 V；碰撞室出口电压：-14 V。

②正离子模式。气帘气：24132 kPa；离子喷雾电压：4 500 V；温度：550 ℃；喷雾电压：40 V；入口电压： 10 V；碰撞室出口电压：13 V。其余质谱条件见表2。

1.2.6 样品处理。

1.2.6.1 供试品溶液制备。

称取试样2.0 g于100 mL比色管中，加50.0 mL水超声提取30 min，冷却后，加入2.0 mL亚铁氰化钾，涡旋振荡混匀，再加入2.0 mL乙酸锌溶液涡旋混匀，加水定容，充分混匀，转移至离心管，5 000 r/min离心5 min，过0.22 μm滤膜，待上机。

1.2.6.2 加标回收率试验。

称取空白样品2.0 g，共9份于100 mL比色管， 1～3份中精密加入对照混合中间液1.5 mL，作为加样回收1， 4～9份中精密加入对照混合中间液5.0 mL，作为加样回收2，其余步骤同“1.2.6.1”供试品溶液制备。

1.2.6.3 检出限溶液制备。

称取空白样品2.0 g于100 mL比色管，加对照混合中间液1.5 mL，其余步骤同供试品溶液制备。

1.2.6.4 样品测定方法。将处理好的待测液放入自动进样器的样品盘上，进样器自动进样5.0 μL，数据采集采用Analyst Software工作站进行采集处理，采用Quantitative Analysis软件进行数据处理，使用外标法进行数据分析，得出样品溶液中各种分析物的质量浓度。再根据以下公式得出检测结果。结果计算用公式（1），回收率计算用公式（2），检出限计算用公式（3）。

式中，W为样品中各分析成分的含量（μg/kg）；C为测得浓度（ng/mL）；V为稀释倍数；M为样品取样量（g）。

2 结果与分析

2.1 质谱与色谱条件的选择

将含有1 μg/mL的各种分析物的对照品混合溶液在正离子和负离子模式下进行全扫描，找到最佳的电离模式。结果显示，除了甜蜜素在正负离子模式下均有一对离子响应较强外，其余成分在负离子模式下响应较强，再进一步优化碰撞能量。在同一分析物中，以响应高的离子对作为定量离子，质谱条件见表2。不同模式下，采用梯度洗脱，使目标化合物能更好地与其他干扰物质分离，结果见图1～2。

2.2 线性关系

将标准品曲线注入液相质谱联用仪，以峰面积为Y轴，相对质量浓度为X轴建立标准曲线，并求出回归方程，结果见表3。结果显示，该方法的线性范围为20～1 000 ng/mL，标准曲线线性良好，其回归方程及相关系数R分别为甜蜜素，Y=3 380X-49 100，R=0.999 7；安赛蜜，Y=8 620X+21 700，R=0.998 7；阿斯巴甜，Y=4 070X-12 400，R=0.999 7；纽甜，Y=5 930X-21 300，R=0.999 4；三氯蔗糖，Y=123X+425，R=0.999 7；甜菊糖苷，Y=332X-967，R=0.997 1。

2.3 回收率及精密度结果

回收率试验结果表明（表4），添加不同浓度的各分析物，甜蜜素回收率均值为119%，RSD值为1.8%；安赛蜜回收率均值为120%，RSD值为8.3%；阿斯巴甜平均回收率为120%，RSD值为1.7%；纽甜平均回收率为113%，RSD值为4.1%；三氯蔗糖平均回收率为114%，RSD值为3.5%；甜菊糖苷平均回收率为83%，RSD值为6.8%。

2.4 样品检测结果及方法检出限

按照“1.2.6”对样品进行前处理，然后进样分析。正负离子模式进行采集，根据标准曲线，待测试的饮料样品中，甜蜜素、安赛蜜及阿斯巴甜含量分别为0.16、0.18、0.006 4 g/kg，其余成分未检出。同时，在该试验条件下，在空白样品中添加标准溶液进行测定，以质谱仪3倍信噪比计算目标物组分的检出限，结果见表5。

3 结论

该研究建立了饮料中甜蜜素等6种非糖类甜味剂含量的分析方法，通过同时采用正负离子模式进行多反应监测，同时检测饮料中6种非糖类甜味剂的含量。结果显示，标准曲线线性良好、回收率高、检出限低。该方法操作简便、快速，是食品中多种甜味剂含量的快速而准确的检测方法。

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