苦瓜辐照花粉授粉离体胚挽救的研究

陈小凤 黄如葵 冯诚诚 黄熊娟 梁家作 黄玉辉 刘杏连（广西农业科学院蔬菜研究所，广西南宁 530007）

苦瓜辐照花粉授粉离体胚挽救的研究

陈小凤 黄如葵*冯诚诚 黄熊娟 梁家作 黄玉辉 刘杏连
（广西农业科学院蔬菜研究所，广西南宁 530007）

为提高辐照花粉授粉不同发育阶段胚的萌发，以剂量为150 Gy的60Co-γ射线进行辐照花粉授粉，利用胚挽救技术进行苦瓜离体胚培养，从培养基、接种方式、光暗处理等方面进行优化研究。结果表明，在不同类型苦瓜中，整粒种子经暗处理10 d后，切掉3/4并保留含胚切块，在MS基本培养基中转光下培养20 d后，可使胚挽救时期提前到授粉后5 d，使授粉后9 d的胚萌发出苗率达9.6%以上，并免去了剥离种皮取胚的步骤，简化了苦瓜离体胚挽救技术。

苦瓜；辐照花粉；胚挽救

与栽培种不同属或不同种的野生或近野生资源，往往具有栽培种没有的抗病虫性、抗逆性，可通过转育其相关基因来改良栽培品种，但这些资源与常规栽培种进行杂交，往往产生胚败育的现象，不能成功获得杂交种，需要在胚败育前进行挽救。单倍体加倍后的双单倍体（DH）为纯合体，只有1种基因型和表现型，优良的纯合系后代可直接作为品种或杂交亲本应用于育种，缩短育种年限，但单倍体自发产生的频率极低，用辐射过的花粉授粉来诱导产生单倍体，也需要在胚败育前进行挽救。离体胚挽救是作物新种质创制的重要手段之一，已广泛运用于杂交育种（崔光芬 等，2014；陈昌文 等，2015）、远缘杂交育种（扈新民 等，2009；乔海云 等，2009）、倍性杂交育种（宋健坤 等，2005；刘可慧等，2010）等研究中。在葫芦科蔬菜方面，胚挽救技术主要应用于单倍体育种（王丽莉和秦智伟，2007）。通过辐照花粉授粉结合胚挽救技术获得单倍体研究始于甜瓜（Sauton & Dumas，1987），多见于黄瓜研究（雷春 等，2006；张永兵 等，2006；苏芃 等，2015）。笔者（陈小凤 等，2011）曾采用辐照花粉授粉结合胚挽救技术，探讨胚挽救时期对成苗率及辐照剂量对形成不同类型胚的影响，以期获得单倍体植株，但没有成功，原因是低发育水平的胚刚好肉眼可见或者根本看不见，剥离种皮取胚操作困难，易伤到胚，受伤的胚易愈伤化，萌发困难，也增加了污染率。为了提高出苗率，简化培养技术，在前期的研究基础上，利用剂量为150 Gy的60Co-γ射线进行花粉辐照授粉结合胚挽救技术进行苦瓜离体胚挽救，从培养基筛选、接种方式、光暗处理等方面进一步优化培养条件，以促进低发育阶段胚萌发，提高出苗率，使胚挽救时期提前，为获得苦瓜单倍体提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为自交系MC6、MC8、MC9、MC39-4、MC72、MC143，由广西农业科学院蔬菜研究所提供。试验材料在瓜形、瓜色、瓜瘤数目和形状、瓜长及瓜横径等特征特性方面各不相同，几乎包括了苦瓜的所有类型，在苦瓜资源中具有一定的代表性，其基本性状见表1。

1.2 试验方法

2014年9月10日、2015年9月16日15：00左右采集次日开放的雄花，装入防水袋中，立即拿到广西辐照中心进行60Co-γ射线辐照，辐照剂量为150 Gy。同时把要授粉的雌花套袋。次日早上用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至坐果。同一材料的雄花授同一材料的雌花。

不同培养基的比较试验：取授粉后9 d果实的种子，切掉3/4不含胚的种皮，保留种子含胚切块并接种到MS及MS+IBA 0.1 mg·L-1培养基中，一直在光下培养，温度（26±2）℃，光强2 000 lx，光照时间8 h·d-1。培养7 d以上时，每天观察出苗情况，并统计出苗率和正常苗比率；每份材料每处理均为60粒种子，3次重复，每重复20粒种子。

出苗率=出苗数／接种种子含胚切块×100%

正常苗比率=正常苗数／接种种子含胚切块×100%

不同接种方式的比较试验：取授粉后9 d果实的种子，整粒种子经暗处理（不开光源且用黑色不透光的塑料布遮光）10 d后，再切掉3/4不含胚的种皮，接种含胚切块于MS培养基中，转光下培养20 d后统计出苗率，以接种整粒种子为对照。每份材料每处理均为60粒种子，3次重复，每重复20粒种子。

不同胚挽救时期的比较试验：取授粉后4、5、6、7、8 d果实的种子，按以上暗处理的方法，统计出苗率。每处理均为24粒种子，3次重复，每重复8粒种子。

胚挽救的大数据试验：取辐照花粉授粉后9 d果实的种子，暗处理后接种含胚切块，除了MC39-4外，其他材料的接种数目都在120块以上，不设重复。

1.3 数据处理及计算

利用Excel 2003软件进行数据作图分析，用DPS 3.01软件进行新复极差方差分析。

表1 试验材料的基本性状

2 结果与分析

2.1 不同培养基对胚萌发出苗率的影响

表2显示，把种子含胚切块接种到MS及MS+IBA 0.1 mg·L-1培养基中，不经暗处理直接在光下培养，出苗率都很低。在MS培养基中，试验材料有1.7%～6.7%的出苗率，但只有MC6获得1株正常苗；在MS+IBA 0.1 mg·L-1培养基中，MC8、MC9、MC143各有1个胚萌发出苗，但最终都未获得正常植株。在2种培养基中，大部分种子含胚切块都愈伤化，最终褐化死亡，没有胚萌发出苗（图1）。说明要提高幼胚萌发出苗，关键在于阻止嫩种子切块愈伤的形成。

表2 不同培养基对胚萌发出苗率的影响

图1 不经暗处理的种子含胚切块的培养效果A和B分别为种子含胚切块在MS和MS+IBA中愈伤化情形，C和D分别为种子含胚切块在MS和MS+IBA中愈伤褐化死亡情形。彩色图版见《中国蔬菜》网站：www.cnveg.org，下图同。

2.2 不同接种方式对胚萌发出苗率的影响

表3显示，暗处理10 d后在MS培养基中转光下培养，以整粒种子作为培养对象的出苗率为0；接种含胚切块并在光下培养，各材料的出苗率都在21%以上，MC8的出苗率最低，为21.7%；MC72的出苗率最高，达38.3%。说明暗处理后在光下接种含胚部分，能有效促进离体胚的萌发出苗（图2）。

表3 不同接种方式对胚萌发出苗率的影响

图2 暗处理后整粒种子与种子含胚切块的培养效果A：暗处理后转光下培养；B：整粒种子褐化死亡；C和D：种子含胚切块培养后萌发出苗。

2.3 不同胚挽救时期对胚萌发出苗率的影响

图3显示，随着胚挽救时期的延后，胚萌发出苗的比率也不断提高。当胚挽救时期提前到授粉后4 d时，仅MC6、MC9、MC143有1个胚萌发出苗，出苗率为4.1%；MC8、MC39-4、MC72没有胚萌发出苗。当胚挽救时期提前到授粉后5 d时，MC9只有1个胚萌发出苗，出苗率最低；MC6有4个胚萌发出苗，出苗率最高，为16.7%。到授粉后7 d以上时，供试材料的出苗率都在25%以上，说明经暗处理后再接种含胚切块，能使胚的挽救时期提前到授粉后5 d，并且胚萌发出苗率与胚的成熟度呈正相关。

2.4 苦瓜胚挽救的大数据试验结果

辐照花粉引起苦瓜授粉障碍，造成同一果实中胚的发育进程不一致（陈小凤 等，2011），由于重复间的出苗率相差较大，无法对重复之间数据进行多重比较分析。因此，要获得比较可靠的参考数据，大数据是有说服力的方法之一。表4显示，MC143接种278块种子含胚切块，出苗率最高，为22.3%；MC72接种322块种子含胚切块，出苗率最低，为9.6%；而接种种子含胚切块最多的MC9，共接种704块，出苗率为10.5%。表4总体的数据表明，在不同类型苦瓜中，利用本试验方法培养授粉后9 d果实种子的含胚切块，能使胚的出苗率达9.6%以上；平均初次萌发即获得正常苗的比率为6.8%。部分初次萌发不正常的畸形苗经多次继代培养后能转化为正常苗，但仍有相当比例的苗未能长成正常苗，正常苗在MS培养基中就能正常生根（图4）。

图3 不同胚挽救时期对胚萌发出苗率的影响

图4 畸形苗类型及正常苗继代培养、生根培养效果A：畸形苗类型；B：萌发苗继代培养；C和D：正常苗生根培养。

表4 苦瓜胚挽救的大数据试验结果

3 结论与讨论

苦瓜在进行外植体培养时，易诱导产生愈伤，而愈伤难以分化不定芽。唐懿（2011）在进行花药培养时，花药愈伤组织的诱导率可达79.42%，结果仅获得1个不定芽和1个3 cm左右的竖状突起，多次继代后褐化死亡，没有成功获得再生植株。武鹏等（2012）以子叶、上胚轴、下胚轴为外植体进行培养，愈伤组织诱导率达80%以上，同样存在愈伤组织难以分化不定芽的问题。在本试验中，授粉后4～8 d的种子含胚切块也属幼嫩组织，在进行离体培养时也一样产生愈伤现象，影响胚萌发出苗，说明苦瓜组织培养很容易产生愈伤，即使是在无激素的MS基本培养基中也一样（图1）。因此，本试验没有就更多培养基成分组合对胚培养的影响进行进一步优化，而直接在MS基本培养基中完成本试验。

在作物离体培养中，培养初期需要先经过一段时间的黑暗处理，目的是提高愈伤组织诱导率和降低外植体褐化率（孙源蔚 等，2011；韩瑞超，2012）。本试验的外植体比较特殊，是幼嫩种子，黑暗处理的目的是模拟种子在果实体内的生长环境，但由于种皮的阻碍，让幼胚无法吸收到培养基中的养分，培养早期胚发育所需营养来自种子内贮存的养分，当养分消耗完时，种子不含胚部分变得干瘪、中空而不含水分，此时切去这部分种子，保留含胚部分再放到光下培养，可以减少愈伤形成，提高胚萌发出苗率（图2-C和2-D）。而整粒种子培养没有胚萌发出苗，可能是幼胚没有能力突破种皮而萌发成苗，种皮也阻碍了胚吸收养分从而导致胚停止发育（图2-B）。本试验的方法能使胚挽救时期提前到授粉后5 d，使授粉后9 d的胚萌发出苗率达9.6%以上。

苦瓜不似黄瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜等葫芦科作物，它们1个子房含有的胚珠就达400粒以上，只要授粉几个瓜就可获得大量的种子进行离体胚培养。不过这些作物单倍体的获得比率也非常低，如苏芃等（2015）在进行黄瓜单倍体研究时，单倍体诱导率只有0.26%～0.54%。苦瓜子房内含有的胚珠只有几十个，要获得同样多的种子进行离体胚培养，得多授几十倍甚至上百倍的果实才会有同样的机会去增加单倍体的获得比率。

据本试验观察发现，苦瓜胚发育为肉眼可见时，有2个变化明显的时期，分别为授粉后8 d和授粉后10 d，授粉后8 d的胚刚好肉眼可见，到授粉后9 d时的变化不大，但到授粉后10 d时，大部分胚已长为种壳的一半大小，授粉后11 d以上，胚的大小已与种壳一样大，成为饱满胚（图5）。因此，本试验中使授粉后5 d的胚发育成苗，对组培中易愈伤的苦瓜来说是非常不易的。

图5 不同授粉天数后的苦瓜种子及离体胚A：授粉后3 d的种子；B：授粉后5 d的种子；C：授粉后6 d的种子；D：授粉后8 d的种子及离体胚（箭头所指，下同）；E：授粉后9 d的种子及离体胚；F：授粉后10 d的种子及离体胚；G：授粉后11 d的种子及离体胚；H：授粉后12 d的种子及离体胚。

综上所述，结合苦瓜授粉胚的发育进程看，虽然本试验未获得单倍体植株，但本试验的结果使胚挽救时期提前到授粉后5 d，以授粉后9 d胚挽救为例，能使胚萌发出苗率达9.6%以上，并免去了剥离种皮取胚的步骤，简化了胚培养的方法。且6个供试材料为不同类型苦瓜，在苦瓜中具有一定的代表性。因此，本试验结果可为获得苦瓜单倍体提供技术支撑。

陈昌文，朱更瑞，王力荣，方伟超，曹珂，王新卫，冯义彬．2015．蟠桃新品种‘中蟠桃 11 号’．园艺学报，42（10）：2089-2090．

陈小凤，黄如葵，黄玉辉，刘杏连，梁家作，周生茂．2011．辐照花粉授粉及胚挽救时期对苦瓜离体雌核发育的影响．北方园艺，（16）：152-154．

崔光芬，王祥宁，蒋亚莲，吴丽芳，贾文杰，段青，王继华．2014．OT百合新品种‘金门’．园艺学报，41（7）：1517-1518．

韩瑞超．2012．桂花幼胚培养与愈伤组织诱导及分化〔硕士论文〕．泰安：山东农业大学．

扈新民，李锡香，梁燕，方智远，沈镝，邱杨．2009．甘蓝与萝卜属间杂交及其胚挽救技术优化．中国蔬菜，（10）：7-12．

雷春，陈劲枫，钱春桃．2006．辐照花粉授粉培育单倍体黄瓜研究．中国农业科学，39（7）：1428-1436．

刘可慧，于方明，张秋明，易干军．2010．应用胚挽救技术获得三倍体柑橘植株．广西植物，30（2）：246-249．

乔海云，李菲，张淑江，章时蕃，孙日飞．2009．大白菜与诸葛菜属间杂交及GISH鉴定．园艺学报，36（10）：1473-1478．

宋健坤，郭文武，伊华林，刘继红，陈春丽，邓秀新．2005．以异源四倍体体细胞杂种为父本与二倍体杂交创造柑橘三倍体的研究．园艺学报，32（4）：594-598．

苏芃，Nguyen H H，管苇，崔利，陈劲枫．2015．辐射花粉授粉技术诱导黄瓜单倍体．江苏农业学报，31（1）：134-137．

孙源蔚，李果果，姚延兴，李国怀．2011．中国李Nubiana 胚性愈伤组织诱导及植株再生．果树学报，28（1）：42-45．

唐懿．2011．苦瓜花药培养及培养过程中内源激素研究〔博士论文〕．成都：四川农业大学．

王丽莉，秦智伟．2007．葫芦科植物单倍体离体诱导研究进展．中国农学通报，（23）：85-89．

武鹏，方锋学，黄如葵，黄熊娟，陈小凤．2012．苦瓜离体再生体系建立的研究．北方园艺，（2）：124-126．

张永兵，陈劲枫，伊鸿平，雷春，吴明珠．2006．辐射花粉授粉诱导甜瓜单倍体．果树学报，23（6）：892-895．

Sauton A R，Dumas D V．1987．Obtention de plants haploids chezs le melon（Cucumis melon L．）par gynogeneses induite parde pollen irradiate．Agronomic，7：141-148．

Studies on Embryo Rescue of Irradiated Pollen Pollination of Bitter Gourd in Vitro

CHEN Xiao-feng，HUANG Ru-kui*，FENG Cheng-cheng，HUANG Xiong-juan，LIANG Jia-zuo，HUANG Yu-hui，LIU Xing-lian
（Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China）

In order to improve the germination of different development stage of embryo of irradiated pollen pollination，this study took 150 Gy dose of60Co-γ to carry out irradiated pollen pollination，and took bitter gourd embryos cultivation in vitro by using embryo rescue technique，which were optimized from the culture medium，inoculation method，light or dark treatments．The results showed that among different types of bitter gourd，treated the whole seed under dark for 10 days and then cut off 3/4 and retained the part with embryo slices，put this part in MS culture medium and under light for 20 days．The embryo rescue stage could be advanced to 5 days after pollination，and the germination rate could reach 9.6% 9 days after pollination．The step of stripping seed peel and isolating embryo from seed was spared．Thus，the embryo rescue technique of bitter gourd in vitro was simplified by this method．

Bitter gourd（Momordica charantia L．）；Irradiated pollen；Embryo rescue

陈小凤，女，硕士，副研究员，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：798581549@qq.com

*通讯作者（Corresponding author）：黄如葵，女，博士，研究员，硕士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种及栽培研究，E-mail：rkhuang@ gxaas.net

2016-12-23；接受日期：2017-05-15

广西自然科学基金项目（2014GXNSFAA118091，2015GXNSFBA139079），广西农业科学院基本科研业务专项（2015YT66），现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-25）