番茄黄化基因Netted Viresce（NV）的遗传定位及生理特性研究

崔丽朋 宋丽华 黄泽军 高建昌 国艳梅 杜永臣 王孝宣（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

番茄黄化基因Netted Viresce（NV）的遗传定位及生理特性研究

崔丽朋 宋丽华 黄泽军 高建昌 国艳梅 杜永臣 王孝宣*
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

以玛娜佩尔为受体亲本，以野生番茄潘那利LA0716为供体亲本，通过多代回交构建近等基因系。对近等基因系中黄化突变（nv）植株和野生型植株的表型性状和主要农艺性状进行分析，并测定叶绿素含量、净光合速率等；利用透射显微镜观察叶绿体超微结构。以回交系BC6为母本与nv植株进行回交，同时BC6植株进行自交，观察并统计BC7及BC6S1群体植株的表型，分析遗传规律；利用BC7S1分离群体进行基因精细定位，结合高通量基因组重测序，筛选仅在黄化突变位点目的区域内的SNP位点，并结合基因注释分析候选基因。结果表明：与正常植株相比，黄化植株表现植株矮小、叶片窄小、叶色黄化，叶片的叶绿素含量、净光合速率显著降低，气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率显著升高。叶绿体超微结构观察显示，黄化植株叶绿体数目减少，类囊体的基粒片层和基质片层未完全分化，垛叠不整齐。遗传分析表明，玛娜佩尔黄化性状受1对隐性核基因控制；利用CAPS和InDel分子标记将NV基因定位于9号染色体标记InD-09-4-1和HP63/64之间，物理距离为51 Mb。玛娜佩尔基因组重测序数据可利用率高，数据比对分析得到7个与光合作用相关的基因。

番茄；叶色突变体；生理特性；遗传分析；基因定位

叶片是绿色植物进行光合作用的主要器官，在植物的生长发育过程中起着至关重要的作用。叶色突变体，又称为叶绿素突变体，是研究植物光合机理、叶绿素生物合成、叶绿体结构、功能及发育、抗病机制及激素生理等代谢过程的理想材料（Parks & Quail，1991；Fambrini et al.，2004），在分析鉴定遗传转化、基因功能、基因间互作等基础研究中具有特殊价值（López-Juez et al.，1998；Larkin et al.，2003）；同时，叶色突变体可作为苗期标记性状用于杂交育种及品种纯度快速鉴定，在良种繁育工作中发挥重要作用；某些叶色突变体性状优良，还可作为品种改良的理想种质资源（苗晗等，2007）。因此，发掘和鉴定新的叶色突变基因，对其进行克隆及分子机理研究，具有重要的理论意义和实际的应用价值。

目前，叶色突变体在烟草（Okabe et al.，1977）、拟南芥（Carol et al.，1999）、水稻（Jung，2003）、玉米（Lonosky & Rodermel，2004）、大麦（Rzeznicka et al.，2005）、黄瓜（苗晗 等，2010）等作物上有较多的研究。已从叶绿素缺失突变体中鉴定克隆出多个调控叶绿素代谢和叶绿体发育的基因，例如叶绿素酸酯a氧化酶基因（CAO）、镁螯合酶H亚基、I亚基和D亚基基因、叶绿体核糖体小亚基17基因（Oster et al.，2000；Schultes et al.，2000）。Chen等（2005）研究发现，拟南芥EGY1基因发生突变，导致类囊体数量大大减少，捕光蛋白复合物明显减少，叶绿体发育异常导致叶色突变。林植芳等（2004）研究发现，水稻叶绿素b缺失可能会导致PSⅡ 系统结构与功能的热稳性降低。叶色突变体没有“午休”现象，且气孔导度较对照组增大，可为光合作用提供更多的原料（叶威，2014）。因此，叶色突变体可用于研究光合色素代谢、叶绿体的结构与功能、光合作用、植物对光照等环境因素的反应方式等生命活动。

在番茄上，有关叶色突变体的研究报道也较多。Terry和Kendrick（1999）报道，番茄黄化突变体au和yg-2为核隐性基因突变，分别是血红色素加氧酶和植物光敏色素合酶基因发生突变。番茄突变体lutescent1和lutescent2叶片和果实中叶绿素合成速率降低而降解速率增加，果肩颜色浅绿，果实成熟时间延迟，表明叶绿体在果实成熟启动中发挥一定作用（Barry & Giovannoni，2012）。Powell等（2012）利用番茄突变体发现GLK可以增加果实中的叶绿素含量，其过表达有利于光合基因的表达以及叶绿体的发育，并能增加果实中糖类和类胡萝卜素的积累，提高果实品质。

玛娜佩尔（Manapal）作为经典的番茄遗传育种材料，是一种叶色突变体，含有的NV基因与Tm-2紧密连锁，对烟草花叶病毒抗性强，且配合力较好，已被作为苗期标记性状广泛应用于番茄抗病遗传育种，但在分子遗传基因NV及植株生理特性方面的研究鲜见报道。高代回交系材料的遗传背景相同，仅在个别染色体片段上存在差异，其株系与受体亲本出现的表型差异理论上认为是差异染色体片段引起的，因此在基因定位方面具有准确、快速、省时的优点。本试验以玛娜佩尔为轮回亲本、潘那利LA0716为供体构建回交近等基因系群体，通过对光合色素含量、叶绿体结构、光合特性等进行测定、观察及分析，研究玛娜佩尔突变体的生理特性；并将传统遗传定位方法与高通量测序筛选稀有突变的研究方法相结合，对nv突变位点进行遗传定位，为NV基因的克隆与分子机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2014年2月至2015年12月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。供试材料为栽培番茄玛娜佩尔、野生番茄潘那利LA0716以及来源于玛娜佩尔与潘那利番茄LA0716杂交后并以玛娜佩尔为轮回亲本构建的回交近等基因系群体BC6、BC6S1、BC7、BC7S1、BC7S2，表型有黄化植株和正常绿叶植株。潘那利起源于秘鲁，耐旱，抗虫性与抗病性强，与栽培番茄杂交亲和性较好，种子来源于Tomato Genetics Resource Center（TGRC，http：// tgrc.ucdavis.edu/）；玛娜佩尔于1975年从美国引入，其植株黄化、生长缓慢，含隐性黄化基因nv，并与Tm-2基因紧密连锁。

采用32孔穴盘育苗，幼苗生长至四叶一心时定植于本所北圃场温室，常规方法管理。利用高代回交群体BC7和BC6S1进行表型调查和分析NV基因遗传规律；以BC6S1和BC7S1为分离群体，在幼苗期利用分子标记筛选出黄化（nv/nv）和正常绿叶（NV/NV）苗各10株，用于调查主要农艺性状及相关生理指标。此外，利用BC7S1（1 200株）和BC7S（2800株）的分离群体进行NV基因遗传定位。

1.2 生理特性分析

1.2.1 农艺性状评价 对于BC6S1群体中的黄化植株和正常植株，在红熟期第1至第3穗果中分别选取10个完全成熟、有代表性的正常果实进行称重，计算平均单果质量；并测定果实可溶性固形物含量。在第4穗果实开始成熟时测定株高，以主茎基部到第4穗果实的高度为测定标准；正常植株和黄化植株各测定10株，取平均值。整个生育期观察叶色变化情况。

1.2.2 光合色素含量测定 当BC7S1群体的黄化植株和正常植株生长至30、60、90 d时，分别选取生长点往下第2至第3片真叶中生长良好的新鲜成熟叶片100 mg，放入15 mL玻璃试管中，在通风橱中加入10 mL乙醇丙酮混合液（乙醇∶丙酮=1 V∶1 V），置于黑暗条件下过夜浸提至叶片组织发白；每处理3次重复。提取液用岛津公司的UV-1800分光光度计分别测定663、645 nm和470 nm波长的OD值，计算叶片叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、类胡萝卜素含量（Caro）和总叶绿素含量（Chl）（杨冲，2014）。

1.2.3 叶绿体超微结构观察 分别选取BC7S1群体黄化植株和正常植株生长点下第2至第3片真叶中新鲜成熟叶片，切成1 mm2左右的均匀小块，尽量避开大叶脉，每株取9小块；样品离体后立即浸入4%戊二醛溶液中进行固定，经磷酸缓冲液漂洗后用1%四氧化锇溶液固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂渗透包埋，切片、染色后在透射电子显微镜下观察（H-7500，Hitachi Limited，JPN），利用扫描相机（832，Gatan，USA）扫描获取照片。透射电镜样品制备和观察均在中国农业科学院农产品加工研究所进行。

1.2.4 光合作用测定 当BC7S1群体的黄化植株和正常植株生长至70、100 d时，采用LI-6400便携式光合仪测定净光合速率（Pn）、气孔导度（G2）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）等指标；正常植株和黄化植株各测定5株，选取生长点下第3至第5片真叶，每株测3次，计算平均值。

1.2.5 数据处理 采用Excel 2007软件和SAS软件进行数据统计分析。

1.3 遗传分析

1.3.1 基因遗传定位 选取第9号染色体SGN（https：//solgenomics.net/）网站上公布的以及本所鲜食番茄课题组自行开发的70个SSR及InDel分子标记对双亲及F1进行遗传分析，共筛选出21个具有多态性的标记；利用21个分子标记对BC7S1和BC7S2群体的2 000株单株进行遗传分析，结合表型鉴定结果对目的基因进行遗传定位。DNA提取采用改良的CTAB法（Fulton et al.，1995）。PCR反应体系（10 μL）：DNA模板1 μL（50～100 ng·μL-1），正、反向引物各0.2 μL（10 μmol·L-1），2×GoTaq GreenMaster Mix 5 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。酶切体系（15 μL）：PCR产物10 μL，限制性核酸内切酶0.2 μL（10 U），10×Buffer 1.5 μL，ddH2O 3.3 μL。将PCR-酶切混合液置于适宜的温度下反应4～16 h；酶切产物经1.5%～1.8%的琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪捕捉图像观察统计。InDel标记扩增产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后观察。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，部分序列如表1所示。

表1 NV基因遗传定位的InDel分子标记

1.3.2 玛娜佩尔基因组重测序及候选基因分析 采用改良的CTAB法提取玛娜佩尔植株幼嫩叶片基因组DNA。由北京贝瑞和康生物技术有限公司进行文库构建、基因组重测序，采用Illumina Hiseq 2500进行双端链特异性测序。玛娜佩尔基因组重测序数据由深圳蓝图基因科技有限公司进行生物信息学分析。

为了快速定位目标突变基因，将玛娜佩尔基因组序列与已公布的360份番茄材料及Heinz1706基因组进行序列比对，获得仅在玛娜佩尔中存在的特异SNP突变位点，再筛选出目的基因区域的纯合SNP（非同义纯合突变，Non-synonymous），以期找到候选基因。

2 结果与分析

2.1 表型及相关农艺性状分析

与近等基因系中的正常植株相比，黄化植株在出苗20 d时表现生长缓慢且矮小，叶片窄小，叶色淡黄（图1）。且在以后的生育期，叶片一直处于黄化状态，整体生长势弱，但能开花结果。

图1 正常绿叶植株（左）和黄化植株（右）的表型彩色图版见《中国蔬菜》网站：www.cnveg.org，下图同。

此外，黄化植株的其他农艺性状也有较大变化，果实偏小（图2），单株产量和单果质量都显著低于正常植株，分别减少了32.87%和33.16%；果实可溶性固形物含量比正常植株低20.75%；4穗果株高比正常植株低49.11%，差异显著（表2）。说明该基因的突变不仅影响到叶色，还对株高、单果质量等农艺性状均有较大影响。

2.2 光合色素含量分析

由表3可知，黄化植株在出苗后30、60、90 d，叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均显著低于正常植株；出苗后30 d和60 d，叶绿素a/b显著高于正常植株；出苗后60 d和90 d，类胡萝卜素含量显著低于正常植株。

2.3 叶绿体超微结构观察

与正常植株相比，黄化突变植株的叶肉细胞叶绿体数目较少，且分布部位不均匀，形状不规则，叶绿体基粒片层发育严重受阻，类囊体片层发育不完全，排列方向变形扭曲，垛叠不整齐，且片层结构模糊，发现有嗜锇颗粒的积累（图3）。这表明黄化突变植株的叶绿体类囊体系统发生了一定程度的损伤。

图2 正常绿叶植株（左）和黄化植株（右）的果实

表2 BC6S1群体正常植株（NV/NV）和黄化植株（nv/nv）的农艺性状比较

表3 BC7S1群体正常植株（NV/NV）和黄化植株（nv/nv）的光合色素含量比较

图3 正常植株与黄化植株叶肉细胞叶绿体超微结构A、C，正常植株（NV/NV）；B、D，黄化植株（nv/nv）。

2.4 光合特性分析

由表4可知，黄化植株的净光合速率在出苗后70 d和100 d比正常植株低53.12%、53.76%，差异显著；而气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率显著高于正常植株。

2.5 基因遗传定位

早期研究报道，玛娜佩尔植株的黄化基因NV与抗烟草花叶病毒基因Tm-2紧密连锁，位于9号染色体，呈隐性遗传（张汉卿 等，1985）。本试验中，突变体玛娜佩尔与潘那利LA0716杂交F1表现为正常绿叶；在高代回交BC6S1群体中表型为正常绿叶植株227株，黄化植株73株，分离比接近3∶1（表5）；在BC7群体中有52株表现为正常绿叶，48株为黄化植株，分离比接近1∶1，经卡方检验符合孟德尔遗传分离定律，表明玛娜佩尔黄化性状由1个隐性核基因控制。

表4 BC7S1群体正常植株（NV/NV）和黄化植株（nv/nv）的光合特性

表5 黄化植株在BC6S1和BC7群体中的分离情况

表6 基因组重测序候选基因

从9号染色体上公布及开发的70个分子标记中筛选出具有多态性差异的8个CAPS标记和13个InDel标记，利用这21个标记对BC7S1和BC7S2群体的2 000株单株进行重组筛选，结合表型鉴定结果将NV基因定位于标记InD-09-4-1和HP63/64之间，物理距离为51 Mb。

2.6 黄化突变体基因组重测序及候选基因分析

利用高通量重测序技术筛选稀有突变的方法，对玛娜佩尔黄化突变体进行全基因组重测序。结果表明，数据质控统计合格，样品经测序及生物信息学分析后共有121 M（具体数目121 312 323）raw reads都是Paired-end，reads比对率为99%，覆盖区域92%，平均深度38 X；共检测到1 278 301个SNP位点，4 810个结构性变异位点，其中包括376个染色体间易位（interchromosomal translocation，CTX）、722个染色体内易位（intra-chromosome translocation，ITX）、2 401个缺失（deletion，DEL）、335个插入（insertion，INS）和976个转置（inversion，INV）。

通过重测序序列比对分析，利用番茄基因组数据库（https：//solgenomics.net/）的基因预测及注释，对黄化突变体9号染色体目的片段SNP位点进行基因预测，得到了28个基因（表6）。其中，Solyc09g015290、Solyc09g015300、Solyc09g015320、Solyc09g015340、Solyc09g018800、Solyc09g059640编码光反应中心蛋白A，又称P700叶绿素a脱辅基蛋白A（P700 chlorophyll a apoprotein A），含有pasA和pasB基因的interpro domain，参与PS Ⅰ蛋白质复合物形成；Solyc09g016930参与光合系统Ⅱ CP43叶绿素脱辅基蛋白（Photosystem Ⅱ CP43 chlorophyll apoprotein）合成，在植物光合作用中起着重要作用。这些基因预测与叶绿素合成或叶绿体发育相关，可能存在黄化突变的候选基因。Solyc09g055890编码1个脂氧合酶，据前人报道，脂氧合酶在植物生长发育、成熟衰老等生命活动中起着十分重要的调节作用，脂氧合酶过氧化物会通过抑制叶绿体的光化学活性、促进蛋白酶失活等方式加速组织老化（Heitz et al.，1997；李彩凤 等，2010）；Solyc09g057530编码一类转录因子同源域-亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）ROC3，同源域亮氨酸拉链蛋白转录因子有多种功能，参与叶的发育、去黄化、脱落酸应答和胚胎发生等生理生化过程（Ariel et al.，2007；Elhiti & Stasolla，2009）；Solyc09g012020编码F-box家族蛋白，主要参与多种植物激素信号转导、逆境胁迫应答等生命活动，及光形态建成、光周期节律等过程（段桂芳，2014；霍冬英 等，2014）；Solyc09g014990是一类WRKY转录因子，广泛参与植物生长发育、形态建成、激素代谢、衰老调控等生命过程（刘波，2012；祖倩丽 等，2015），也可能与黄化突变相关，候选基因有待进一步确定。

3 讨论

本试验中，番茄黄化突变体玛娜佩尔nv位点突变，植株表现矮小、叶片窄小、叶色黄化，变异性状稳定，易于鉴定。Liu等（2007）报道，一些水稻叶绿素缺失突变体中具有植株矮化特征。突变体植株叶片的叶绿素含量显著低于正常绿叶植株，类胡萝卜素含量降低幅度较小，这与多数黄化突变体如烟草、大麦、水稻、油菜的研究结果相同（胡忠 等，1981；谭新星 等，1996；董遵 等，2000；雷红梅 等，2010）；叶绿素a/b值较大，与大部分叶色黄化突变体的叶绿素a/b值高于野生型也相一致（肖华贵，2013）。研究表明，当叶片中的类胡萝卜素合成受阻、含量下降时，不能起到保护叶绿素的作用，会导致叶绿素代谢异常，从而形成叶绿素缺失突变体（Koski & Smith，1951；Wallace & Schwarting，1954）。nv突变体可能是由于调控叶绿素合成途径中的相关基因发生突变，致使代谢途径发生变化，阻碍了叶绿素的合成；且很可能是在叶绿素a与叶绿素b合成分支前产生了干扰，主要是因为叶绿素a到叶绿素b的转化过程并没有受到影响。

本试验中，黄化突变体体内的叶绿体数目较少，分布不均匀，类囊体片层结构发育不完全，叶绿体类囊体的系统受损，其净光合速率比正常植株低50%以上，与叶绿素含量的降低比例基本一致，这表明nv突变体很可能是由于叶绿素含量的大幅度减少、叶绿体结构的严重受损影响了叶片的光合功能，致使净光合速率降低。有研究表明，光合机构系统的功能平衡缺失，特别是类囊体结构对光能的吸收和电子传递同暗反应利用同化能力之间的失衡，是导致叶色突变体光合能力降低的关键因素（许晓明 等，2004）。

由于nv位于着丝粒附近与Tm-2紧密连锁，存在严重的重组抑制，交换频率低，阻碍了常规图位克隆方法进行基因的精细定位及克隆。本试验利用稀有突变的基因克隆方法，将突变体的全基因组重测序数据与360份材料数据进行对比分析，找到仅在突变体目的区域（基因上下游各1 kb之间的区域，包含启动子等结构）含有的纯合SNP突变位点。由于本试验得到的SNP差异位点较多，得到28个候选区域基因，其中7个与光合作用相关，因此候选基因有待进一步研究确定。今后将在此基础上扩大分离群体，筛选重组单株，缩小基因的定位区间；同时，通过转基因试验验证7个叶绿素合成相关基因；此外，基因区间的SNP位点也可能会影响基因的功能，应进一步加深测序数据的分析与挖掘。

4 结论

番茄黄化突变体玛娜佩尔的叶色黄化、叶片窄小、植株矮小，变异性状稳定。本试验通过光合色素含量分析、叶绿体结构观察、光合特性研究等发现，黄化植株叶片的叶绿素含量及净光合速率显著下降，且降低幅度较大；气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率显著升高；叶绿体数目减少，类囊体的基粒片层和基质片层未完全分化，垛叠不整齐。玛娜佩尔黄化性状受1个隐性核基因控制，其NV基因被定位于9号染色体分子标记InD-09-4-1和HP63/64之间，物理距离为51 Mb。由于nv位于着丝粒附近与Tm-2紧密连锁，存在严重的重组抑制，交换频率低，将传统遗传定位方法同稀有突变的研究方法相结合，利用黄化突变体重测序数据与已公布的番茄材料测序数据进行序列比对，预测得到目的区域28个候选基因，其中7个与光合作用相关。

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Physiological Characteristics and Genetic Mapping of Tomato Yellow Leaf Gene Netted Viresce（NV）

CUI Li-peng，SONG Li-hua，HUANG Ze-jun，GAO Jian-chang，GUO Yan-mei，DU Yong-chen，WANG Xiao-xuan*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Near-isogenic lines derived by back-crossing were developed by using ‘Manapal’ as the recipient parent and wild-type tomato ‘Spennelllii LA0716’ as a donor parent．Ten ‘Manapal’ plants and 10 wild type（WT）NIL plants were selected to analyze their main agronomic traits，and measure chlorophyll content and photosynthetic characteristics．The ultra-structure of chloroplast was observed with transmission microscope．The segregation ratios of the seedlings with normal and yellow leaves in BC7and BC6S1populations were calculated and used for genetic analysis of nv．The BC7S1population was used for fine mapping of nv．The SNPs within the region of nv were identified by the alignment re-sequencing result of ‘Manapal’ and wild type tomato materials．Compared to WT plant，nv plant height was lower，nv leaves were narrower，its leaf color is yellowing．The content of chlorophyll，net photosynthetic rate were remarkably reduced．Stomatal conductance，inter-cellular CO2concentration and transpiration rate significantly went up in nv plants．In addition，the number of chloroplasts of nv plants was reduced．The grana lamellae and stroma lamellae of thylakoid stacking were not fully differentiated and irregularly arranged．These results suggested that the yellow leaf trait was controlled by a single recessive gene．The gene NV was mapped in a 51 Mb region on chromosome 9，between InDel makers 09-4-1 and HP63/64．Seven genes related to photosynthesis were identified in this region．

Tomato；Leaf color mutant；Physiological character；Genetic analysis；Gene mapping

崔丽朋，女，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：cuilipeng502@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：王孝宣，男，研究员，硕士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：wangxiaoxuan@caas.cn

2017-04-04；接受日期：2017-05-26

国家自然科学基金项目（31672153），大宗蔬菜产业技术体系项目（CARS-25）