十子代平方组方中药及其主要成分抑制α-葡萄糖苷酶的实验研究※

2017-07-07 13:16董思圻李继安田春雨高秀娟李晓永程瑞婷付茜茹周雪梅
河北中医 2017年6期
关键词:莱菔子菟丝子波糖

董思圻 李继安 田春雨 高秀娟 李晓永 程瑞婷 付茜茹 吴 博 周雪梅

(华北理工大学中医学院2013级硕士研究生,河北 唐山 063000)

实 验 研 究

十子代平方组方中药及其主要成分抑制α-葡萄糖苷酶的实验研究※

董思圻 李继安 田春雨△高秀娟 李晓永1程瑞婷 付茜茹 吴 博 周雪梅

(华北理工大学中医学院2013级硕士研究生,河北 唐山 063000)

目的 探究十子代平方的10种组方药物以及每种药物的主要成分对α-葡萄糖苷酶活性的影响,明确该方对α-葡萄糖苷酶起抑制作用的主要成分。方法 利用蔗糖为底物的体外α-葡萄糖苷酶筛选模型,以葡萄糖氧化酶法测定10种中药及主要成分对α-葡萄糖苷酶的抑制率;以阿卡波糖为阳性对照,分别计算各实验组的抑制率和半数抑制率(IC50)。结果 10种中药及10种单体成分均有一定α-葡萄糖苷酶抑制作用。其中,菟丝子、茺蔚子、五味子、莱菔子、紫苏子5种中药和迷迭香酸、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐3种成分的抑制作用较强,呈明显的浓度-效应关系。当浓度为125 mg/mL时,紫苏子、菟丝子、五味子、莱菔子、茺蔚子的抑制率分别为58.49%、55.32%、54.01%、53.13%和50.67%,同浓度阿卡波糖的抑制率为92.09%;当浓度为40 mmol/L时,迷迭香酸、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐的抑制率分别为93.52%、87.10%、78.11%,同浓度阿卡波糖的抑制率为90.89%。菟丝子、茺蔚子、五味子、莱菔子、紫苏子、迷迭香酸、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50分别为44.401、89.608、72.146、82.139、21.549、0.412、0.605、0.860和0.376 mg/mL。结论 10种中药及10种单体成分均可一定程度上抑制α-葡萄糖苷酶,中药菟丝子、茺蔚子、五味子、莱菔子、紫苏子和单体迷迭香酸、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐对α-葡萄糖苷酶的抑制力较强。

糖尿病,2型;中药;药物作用;药理学;α-葡萄糖苷酶

α-葡萄糖苷酶是机体糖吸收过程中的关键酶,饮食中的淀粉、麦芽糖、糊精、蔗糖等碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下才能水解为葡萄糖被小肠上皮吸收入血[1]。α-葡萄糖苷酶抑制剂可竞争性抑制肠道α-葡萄糖苷酶的活性,使淀粉、麦芽糖等分解为葡萄糖的速度减慢,延缓人体对葡萄糖的吸收,从而有效地降低餐后高血糖、减轻高糖毒性,对糖尿病防治有重要意义。前期实验“五子降糖方改善2型糖尿病(T2DM)大鼠糖代谢作用的研究”证实了该方具有补肾化浊的作用,能够降低2型糖尿病大鼠丙二醛(MDA)、调节糖代谢,有较好的抗氧化和糖调节作用[2]。故课题组以五子降糖方为基础,又加入茺蔚子、枸杞子、栀子、五味子、决明子5味中药,组成复方“十子代平方”。本研究通过体外实验,探讨十子代平方在α-葡萄糖苷酶抑制方面的作用,明确其发挥苷酶抑制作用的主要中药和有效成分,为今后组分中药的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器 迷迭香酸(批号:20141027),购于上海金德生物科技有限公司;京尼平苷酸(批号:111828-201102),大黄酚(批号:110796-201319),盐酸水苏碱(批号:110712-201312),甜菜碱(批号:110894-200503),芥子碱硫氰酸盐(批号:111702-201303),特女贞苷(批号:111926-201404),金丝桃苷(批号:111521-201406),栀子苷(批号:110749-201316),五味子甲素(批号:110764-201312),阿卡波糖(批号:100808-201203),均购于中国食品药品检定研究院;α-葡萄糖苷酶(批号:SLBJ8746V),购于sigma公司;葡萄糖测定试剂盒(批号:143251),购于中生北控生物科技股份有限公司;车前子、茺蔚子、枸杞子、决明子、莱菔子、女贞子、菟丝子、栀子、紫苏子、五味子,购于北京同仁堂唐山连锁药店,经田春雨副教授鉴定。M200PRO酶标仪(瑞士TECAN公司);BS224S电子天平SOP(德国赛多利斯公司);8685笔型酸碱计(衡欣科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 中药水提液的制备 莱菔子、菟丝子、车前子、女贞子、茺蔚子、枸杞子、栀子、决明子、紫苏子、五味子各取20 g加100 mL蒸馏水,室温浸泡30 min,微火煎煮2次共1 h,合并2次煎煮液过滤浓缩至20 mL,得到10种中药水提液(相当于1 g/mL生药),4 ℃保存备用。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶体外筛选模型的建立[3]以96孔板为反应载体,每个样品做2个副孔。设定反应容积为120 μL。反应体系为:加入酶液20 L,磷酸盐缓冲液(pH=6.8)60 μL,分别加入不同浓度10味中药、10种成分、阿卡波糖溶液20 μL,37 ℃温箱反应5 min,然后加入20 μL最适浓度的蔗糖溶液为底物,37 ℃反应30 min后,加入Na2CO3溶液100 μL终止反应。

反应生成的葡萄糖,采用葡萄糖氧化酶法测定。提前20 min取出试剂盒,平衡至室温。试剂盒包括2瓶液体,分别为R1、R2,将二者混匀即为工作液。96孔板中加样品1 μL,工作液150 μL,混匀后放入37 ℃温箱,保温10 min。取出孔板,用酶标仪在650(单孔)nm处测定吸光度A,同时在505(多孔)nm处,测定吸光度B。B-A即得到排除中药单体颜色的吸光度值(A样品)。

α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式:抑制率=[(A空白-A样品)/A空白]×100%。

1.2.3 反应体系的优化 为了建立α-葡萄糖苷酶抑制作用体外模型最佳反应体系,实验前分别对酶浓度、底物浓度和反应时间按三因素四水平正交设计进行实验。选定因素和水平见表1。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制作用体外模型最佳反应体系筛选因素水平表

2 结 果

2.1 反应体系优化正交实验结果 见表2。

表2 反应体系优化正交实验结果

由表2可见,三因素四水平正交实验得到了优化的体外实验反应体系,确定最佳反应因素:底物为1 mol/L蔗糖,酶液浓度为1.25 mg/mL,反应时间为40 min。

2.2 10种中药有效成分和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率比较 见表3。

表3 10种中药有效成分和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率比较 ±s

与阿卡波糖组比较,*P<0.05,△P<0.01

由表3可见,随着浓度的增加,迷迭香酸、金丝桃苷和芥子碱硫氰酸盐3种成分溶液α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐渐增强,有明显的浓度-效应关系,其中迷迭香酸作用最强,浓度在40 mmol/L(14.41 mg/mL)时抑制率为93.52%,超过了同浓度下阿卡波糖(25.82 mg/mL)的抑制率90.89%;其次是金丝桃苷,当金丝桃苷浓度达到40 mmol/L(18.57 mg/mL)时,其对α-葡萄糖苷酶的抑制率已达87.10%;芥子碱硫氰酸盐对α-葡萄糖苷酶也显示出较强的抑制作用,当芥子碱硫氰酸盐浓度达到40 mmol/L(14.74 mg/mL)时,抑制率为78.11%,相当于浓度10 mmol/L(6.46 mg/mL)阿卡波糖的作用。

2.3 10味中药水提液对α-葡萄糖苷酶抑制作用的筛选 选择5 mg/mL和50 mg/mL 2个浓度对10味中药的水提液进行酶抑制作用的初筛,其中茺蔚子、莱菔子、紫苏子、五味子、菟丝子5味中药的抑制作用较强,浓度为50 mg/mL时抑制率分别为50.79%、50.07%、50.99%、51.34%和50.22%,同浓度阳性对照药阿卡波糖的抑制率为87.69%,其它样本的抑制率均在50%以下。根据初筛结果,对茺蔚子、莱菔子、紫苏子、五味子、菟丝子5味中药开展进一步浓度效应的测定。实验显示:随着药液浓度的增加,5味中药水提液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐渐增强,呈显著的浓度-效应关系,当浓度为125 mg/mL时抑制作用由强到弱依次为:紫苏子>菟丝子>五味子>莱菔子>茺蔚子,抑制率分别为58.49%、55.32%、54.01%、53.13%和50.67%。阳性对照阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用最强,浓度为125 mg/mL时抑制率达92.09%。初筛和复筛结果见表4、表5。

表4 十子代平方10种组方中药水提液和阿卡波糖溶液α-葡萄糖苷酶抑制剂的初筛结果

表5 5味中药水提液和阿卡波糖溶液对α-葡萄糖苷酶抑制作用的浓度效应

2.4 茺蔚子、莱菔子、苏子、五味子、菟丝子、迷迭香酸、芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50 见表6。

表6 5种中药及4种成分对α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50 mg/mL

3 讨 论

抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性是治疗2型糖尿病的重要靶向之一,对控制餐后血糖、调节糖稳态、降低糖尿病并发症具有重要意义[4]。已经上市的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇[5],该类药物虽然在临床应用中均取得良好疗效,但严重的胃肠道反应一定程度限制了其使用范围[6]。2型糖尿病病因病机繁杂,发病条件广泛,单用该类药物难以解决糖尿病患者整体代谢紊乱的问题[7]。因此,阐释有效方药的多靶点作用机制、明确总方不同作用靶向的活性成分、开发作用靶向明确的高活性配方中药已经成为中药现代化的新方向。本研究从治疗2型糖尿病的有效复方“十子代平方”入手,利用蔗糖为底物的α-葡萄糖苷酶体外筛选模型,探求该方发挥抑制α-葡萄糖苷酶的有效药物成分。

“十子代平方”由菟丝子、莱菔子、车前子、茺蔚子、枸杞子、决明子、女贞子、栀子、紫苏子、五味子组成,以菟丝子、莱菔子益肾,化痰,为君;女贞子、枸杞子、五味子固本益精,紫苏子降气化痰,为臣;茺蔚子、栀子、决明子、车前子清热消瘀,通利泄泻,为佐、使。全方集补肾益精、理气化痰、清热活血于一体,能够促进机体糖代谢,明显降低空腹、餐后、随机血糖及糖化血红蛋白水平。

近期研究表明,五味子、枸杞子、栀子、女贞子、决明子等中药能够抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性,阻断碳水化合物分解为葡萄糖,控制餐后血糖的升高[8-13];菟丝子多糖、齐墩果酸等生物单体对人体的糖脂代谢有一定改善作用[14-15]。本实验以α-葡萄糖苷酶为作用靶点,建立体外α-葡萄糖苷酶活性抑制作用筛选模型,结果发现10味中药以及10种单体成分(车前子—京尼平苷酸;茺蔚子—盐酸水苏碱;枸杞子—甜菜碱;决明子—大黄酚;莱菔子—芥子碱硫氰酸盐;女贞子—特女贞苷;菟丝子—金丝桃苷;栀子—栀子苷;紫苏子—迷迭香酸;五味子—五味子甲素)对α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用,菟丝子、茺蔚子、五味子、莱菔子、紫苏子5种中药和迷迭香酸、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐3种成分的抑制作用较强,当浓度为125 mg/mL时,菟丝子、茺蔚子、五味子、莱菔子、紫苏子的抑制率分别为55.32%、50.67%、54.01%、53.13%、58.49%,同浓度阿卡波糖的抑制率为87.69%,当浓度为40 mmol/L时,迷迭香酸、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐的抑制率分别为93.52%、87.10%、78.11%,与同浓度阿卡波糖90.89%的抑制作用相近,且呈明显的浓度-抑制效应关系。

实验结果表明,十子代平方10味组方中药能够抑制α-葡萄糖苷酶活性,菟丝子、茺蔚子、五味子、莱菔子、紫苏子是抑制该酶活性的主要中药,迷迭香酸、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐是该方发挥降糖作用的主要有效成分。本实验首次发现芥子碱硫氰酸盐具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用,为中药莱菔子降糖作用的进一步研究提供实验依据。

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(本文编辑:董军杰)

Experimental Study on the inhibitory effects of Shizi daiping Formula and its main ingredients on α-glucosidase

DONG Siqi*, LI Ji'an, TIAN Chunyu,et al.

*2013-Grade Master of College of Traditional Chinese Medicine Affiliated to North China University of Science and Technology, Hebei, Tangshan 063000

Objective To explore and study the effects of 10 kinds of Chinese herbs of Shizi daiping formula and their main ingredients on the activity of α-glucosidase, and definite the main ingredient of inhibitory effect on α-glucosidase. Methods Sucrose as a substrate was used to develop an in vitro screening model of α-glucosidase, the inhibition rate of 10 kinds of Chinese herbs and their main ingredients on α-glucosidase was detected by glucose oxidase method. Acarbose was used as the positive control, and the inhibition rate and IC50 in each experimental group were calculated. Results 10 kinds of Chinese herbs and 10 kinds of monomer ingredients have a certain inhibitory effect on α-glucosidase. 5 kinds of Chinese herbs were dodder, fructus leonuri, schisandra, semen raphani, perillaseed and 3 kinds of ingredients were rosmarinic acid, hyperin, sinapine thiocyanate, which had stronger inhibitory effect on α-glucosidase and showed a significant relationship of concentration-effect. When concentration was 125 mg/mL, the inhibition rates of perillaseed, dodder, schisandra, semen raphani, fructus leonuri were 58.49%, 55.32%, 54.01%, 53.13% and 50.67% respectively, and the acarbose was 92.09%. When concentration was 40 mmol/L, the inhibition rates of rosmarinic acid, hyperin and sinapine thiocyanate were 93.52%, 87.10%, 78.11% respectively, and the acarbose was 90.89%. The IC50 of the inhibitory effect of dodder, fructus leonuri, schisandra, semen raphani, perillaseed, rosmarinic acid, hyperin, sinapine thiocyanate and acarbose on α-glucosidase were 44.401 mg/mL, 89.608 mg/mL, 72.146 mg/mL, 82.139 mg/mL, 21.549 mg/mL, 0.412 mg/mL, 0.605 mg/mL, 0.860 mg/mL and 0.376 mg/mL respectively. Conclusion 10 kinds of Chinese herbs and 10 kinds of monomer ingredients have inhibitory effect on α-glucosidase in a certain extent. The Chinese herbs of dodder, fructus leonuri, schisandra, semen raphani, perillaseed and the monomers of rosmarinic acid, hyperin, sinapine thiocyanate have stronger inhibitory effect on α-glucosidase.

Diabetes, type 2; Traditional Chinese medicine; Drug action; Pharmacological; α-glucosidase

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.06.018

※ 项目来源:河北省科技计划项目(编号:13392502D);河北省自然科学基金资助项目(编号:H2015209025);河北省高等学校科学技术研究项目(编号:QN2015119)

董思圻(1987—),女,硕士研究生在读。从事中医糖脂代谢疾病研究工作。

R345.62;R345;R977.3;R587.1

A

1002-2619(2017)06-0875-05

2017-04-01)

△ 通讯作者:华北理工大学中医学院中药学教研室,河北 唐山 063000

1 河北省唐山市传染病医院传染科,河北 唐山 063000

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