类风湿关节炎患者关节液中miRNA表达谱研究及其临床意义

李 力, 罗晓星

(解放军第458医院, 1. 检验科; 2. 干部病房, 广东 广州, 510062)



类风湿关节炎患者关节液中miRNA表达谱研究及其临床意义

李 力1, 罗晓星2

(解放军第458医院, 1. 检验科; 2. 干部病房, 广东 广州, 510062)

目的 检测类风湿关节炎(RA)患者与健康对照者关节液中miRNA表达谱差异及临床意义。方法 应用miRNA芯片技术检测3例RA患者和3例正常人关节液中miRNAs表达情况，筛选出表达差异显著的miRNAs, 并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。进一步研究候选miRNA与RA临床和实验室指标的相关性。结果 RA患者关节液miRNA表达谱中23个miRNA较健康对照者发生显著改变。qRT-PCR检测结果与芯片结果相符。RA患者与健康对照者关节液中miR-146a的表达差异最为显著。Pearson相关分析显示, RA患者关节液中miR-146a的表达与类风湿因子(RF)和DAS28评分呈正相关。ROC曲线分析结果显示, miR-146a曲线下面积(AUC)为0.71, 关节液miR-146a预测RA的灵敏度为85.29%, 特异度为61.54%。结论 RA患者关节液与健康人关节液存在表达差异显著的miRNAs。miR-146a在RA患者关节液中表达显著升高，其水平与RA的临床和实验室指标存在显著相关性。

类风湿关节炎; miRNA芯片; 关节液; miR-146a

类风湿关节炎(RA)是一种以关节、滑膜的慢性炎症以及后期关节软骨和骨质破坏为主要特点的全身性自身免疫性疾病[1]。RA会导致关节畸形和活动受限，最终导致病变关节功能障碍甚至功能丧失。RA病因及发病机制尚不明确，也缺乏疗效确切的治疗手段。MicroRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物细胞中的一类内源性的、非编码的单链小分子RNA。miRNA具有调控多个上游基因表达和下游蛋白翻译的能力，具有调控包括恶性肿瘤形成、免疫炎性反应等病理过程的能力[2]。大量的研究[3-4]显示，miRNAs在RA发生发展的调控机制中起着非常重要的作用。本研究通过miRNA芯片技术检测RA患者与健康对照者关节液中miRNA表达谱差异，分析其与RA临床指标的相关性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

miRNA芯片检测对象为解放军第458医院接受治疗的3例临床确诊的RA患者和3例健康对照者。6例研究对象均为女性，年龄40～57岁。另选择60例临床确诊的RA患者和30例健康对照者作为研究对象，进行RA早期诊断标志物miRNA的筛选以及与临床病理特征关系的研究。60例RA患者中男15例，女45例，年龄38～58岁，平均(46.9±11.5)岁; 患病时间(4.2±2.7)年。所有入选RA患者均符合2010年美国风湿病学会(ACR)修订的RA诊断标准。排除因其他疾病而引起的关节炎，且检查前1周均未使用过糖皮质激素或非甾体类抗炎药物。本研究受试者均签署知情同意书，并经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 关节液标本收集：患者取平卧位，膝关节局部消毒麻醉后，取髌上外侧入路行膝关节腔穿刺，注射器抽取关节液约2 mL。室温下静置1 h, 上离心机2 000 r/min离心15 min, 取上清-80 ℃冰箱保存待检。

1.2.2 miRNA芯片检测: ① 总RNA提取：采用Trizol试剂对关节液总RNA进行提取。经过RNA分相、沉淀、洗涤、溶解后, RNA电泳检测提取RNA分子的完整性, Nanodrop ®ND-1000测定提取RNA的浓度。使用Nanodrop测定RNA 在分光光度计260、280和230 nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。② 制备荧光标记探针：采用miRCURYTMArray Power 标记试剂盒，将Hy3TM荧光基团标记miRNA制备荧光标记探针。③ miRNA芯片杂交、芯片扫描和数据分析：将标记好的探针和miRCURYTM芯片放入PhalanxTM的热收缩杂交袋进行杂交反应。使用GenePix 4000B芯片对芯片进行原始图像扫描，并将实验结果转换成数字型数据保存。芯片实验数据采用GenePix pro V6.0软件对数据聚类分析，计算两种检测信号的比值(1og2)。

1.2.3 实时荧光定量PCR验证：基于芯片结果，对miRNA Foldchange值改变≥2的miRNAs进行验证。miRNA及U6引物序列购于天根生化科技(北京)有限公司。关节液总RNA提取方法步骤同上。逆转录(RT)反应按照miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步骤构建10 μL反应体系: RNA 3 μL, 1×mirVana RT Primer 1 μL, Array script Enzyme Mix 0.4 μL, mirVana RT Buffer(5×) 2 μL, 加RNase-free water至总体积10 μL。反应条件: 37 ℃, 15 min; 42 ℃, 50 min; 85 ℃, 5 min。按照miRNA SYBR Green PCR Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步骤进行qRT-PCR反应。反应条件: 95 ℃, 15 min; 95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s共40个PCR循环。实验重复3次，以U6 snRNA作为内参，数据采用2-ΔΔCT法进行分析(CT值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)。采用2-ΔΔCT法对miR-146a表达相对值进行分析。

1.2.4 RA临床和实验室指标检测: DAS28评分[5]: ① 压痛关节数：检查双侧近端指间关节、掌指关节、腕关节、肘关节、肩关节及膝关节计28个关节，得出关节触痛或被动活动时的关节触痛数; ② 肿胀关节数：检查上述28个关节肿胀与否，得出肿胀关节数; ③ 红细胞沉降率(ESR); ④ 最近7 d患者健康状况或患者对RA病情活动的总体评价：采用0～10 cm标尺, 0表示病情无活动, 10表示病情极度活动，中间部分表示RA不同程度的病情活动，数字越大表示病情活动性越强。DAS 28=0.56×压痛关节数+0.28×肿胀关节数+0.70×Ln(ESR)×0.014×患者健康状况评分。DAS 28范围从0～10分，得分越高提示病情活动性越高。类风湿因子(RF)检测：采用日立7100型全自动生化分析仪，用免疫速率散射比浊法测定RA患者关节液RF浓度水平。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 miRNA芯片结果

miRNA芯片检测将表达差异显著的标准设为：改变倍数上调的或下调2倍以上(P<0.05)。结果如下: RA患者关节液miRNA表达谱中23个miRNA较健康对照者发生显著改变(表达差异≥2倍)。其中表达上调≥2倍的miRNAs有16个，表达下调≥2倍的miRNAs有7个。见表1。

2.2 qRT-PCR验证芯片结果

以U6 snRNA为内参，检测miRNA芯片结果中表达差异显著的23个miRNAs。qRT-PCR实验中RA患者和健康人关节液中该23个miRNAs表达水平差异情况与芯片的结果是一致的。

表1 RA患者和健康对照者关节液中差异性表达的miRNAs

2.3 RA患者同健康对照组关节液miR-146a表达水平比较

作者选择miRNA芯片结果中表达差异最显著的miR-146a作为候选miRNA进一步检测。采用qRT-PCR检测60例RA患者和30例健康对照者关节液miR-146a表达水平。结果显示：健康对照组人群关节液miR-146a相对表达水平为0.227±0.031, RA患者关节液miR-146a表达显著升高，其相对表达水平为1.731±0.306, 差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 miR-146a与RA临床和实验室指标的相关性分析

Pearson相关分析结果显示, RA患者关节液miR-146 a表达水平与RF数值和DAS 28评分呈正相关(r=0.472、0.587,P<0.05)。见图1。

图1 miR-146a水平与左室重构程度相关性

2.5 miR-146 a表达水平对RA的诊断效能

以miR-146a相对表达量进行ROC曲线分析，结果显示, miR-146 a曲线下面积(AUC)为0.71(P<0.01); 关节液miR-146 a预测RA的灵敏度为85.29%, 特异度为61.54%。

3 讨 论

随着医学界对miRNA开展了广泛和深入研究, miRNA在各种疾病发生发展中的作用也越来越受到大家的重视。miRNA能通过碱基互补配对的形式与靶基因的3′UTR部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者直接抑制转录产物的翻译，最终在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA的发现揭示了一种新的基因表达调控方式，即不同miRNA和靶基因之间能够形成复杂的调控网络，发挥精细调控功能基因表达的作用[6]。从miRNA与免疫系统的关系来看, miRNA在固有免疫和适应性免疫以及炎症因子的信号转导过程中起着重要的调节作用。由于自身免疫功能的紊乱和细胞因子的分泌异常是导致RA发病的关键因素[7]。因此，针对miRNA与RA疾病之间的关系也开展了一系列相关研究。2008年Stallczvk等[8]采用RT-PCR方法检测发现, RA患者滑膜组织中miR-155和miR-146a的表达明显高于正常滑膜组织。进一步研究发现, TNF-α、IL-1β、LPS、细菌脂蛋白和poly(I-C)等炎症相关因子可诱导miR-155的产生。增强miR-155的表达则可以通过Toll样受体配体(TLR)和细胞因子来抑制基质金属蛋白酶3(MMP-3)的水平。郑锡铭等[9]对比研究发现, RA患者血清和关节液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106和miR-130的表达水平明显高于普通骨关节炎和健康人。相关分析显示，这些miRNAs与RA的活动性指标RF、ESR和CRP呈正相关。因此，对miRNA和RA之间关系的研究，不仅有助于明确RA发病机制，更可为RA的诊断和治疗提供新的切入点。

随着高灵敏性基因检测芯片和PCR技术的应用，目前在人体液(如血液、腹腔液、关节液、精液等)中能够检测到丰富并且稳定表达的miRNAs[10]。此外，不同疾病相关体液中miRNAs表达谱和表达水平也不同。这种异常改变不仅与疾病病变情况密切相关，也具有很强的特异性。这些特性提示体液中的miRNAs可以作为潜在的疾病生物标志物。关节液主要由关节滑囊和腱鞘的滑液膜分泌。临床研究[11]证实，关节部位的疾患会导致分泌的关节液中出现病变代谢产物并潴留于关节腔。因此，关节液分子标志物的检测也是目前关节部位疾病诊断、疗效检测和预后评估最敏感、最有效的指标。本研究首先使用高灵敏的miRNA芯片来初步筛选出RA患者关节液中差异性表达的miRNAs。结果显示与健康人相比，在RA患者关节液中发现23个明显异常表达的miRNAs。其中表达上调≥2倍的miRNAs有16个，表达下调≥2倍的miRNAs有7个。其中表达差异最显著的miR-146a, 其在RA患者关节液中的表达水平为健康人的10多倍。进一步采用荧光定量PCR的方法对芯片检测结果进行验证，结果显示23个异常表达miRNAs在RA患者关节液中表达情况与芯片结果一致。

miR-146a是目前广泛报道的与固有免疫调节、炎症反应和恶性肿瘤发生发展密切相关的miRNA[12]。有研究证实, miR-146a能够通过TLRs/NF-kB炎症通路来调控炎症反应[13-14]。Nakasa等[15]研究发现miR-146a在RA患者关节滑膜组织中表达显著升高。而体外采用TNF-α和IL-1β刺激能够增强滑膜纤维细胞miR-146a的表达。提示miR-146a与RA炎症反应过程密切相关。本研究中我们选择miR-146a作为候选miRNA进一步检测。通过荧光定量PCR检测60例RA患者和30例健康对照者关节液miR-146a表达差异情况。RA患者关节液miR-146a表达水平显著高于健康对照组人群的。DAS 28评分和RF为目前临床上常用的RA患者病情监测评估指标。DAS 28评分和RF数值越高，RA病情活动度越大，病情越严重。Pearson相关分析显示RA患者关节液miR-146 a表达水平与RF数值和DAS 28评分呈正相关。提示关节液miR-146 a水平能够反映RA疾病活动性，能够作为RA疾病活动性的标志物。进一步采用ROC曲线分析关节液miR-146 a水平对RA的诊断效能。结果显示, miR-146 a曲线下面积(AUC)为0.71(P<0.01); 关节液miR-146 a预测RA的灵敏度为85.29%, 特异度为61.54%。

综上所述，针对RA患者关节液中miRNAs的研究有助于了解RA的发病机制。通过对关节液中RA特异性miRNA检测，有利于早期诊断RA, 并且对RA疾病严重程度和活动性进行评估。

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Gene expression profile of miRNA in joint fluids of patients with rheumatoid arthritis and its clinical significance

LI Li1, LUO Xiaoxing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory; 2.CadreWard,The458thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Guangzhou,Guangdong, 510062)

Objective To detect the gene expression profiles of miRNA in joint fluids of patients with rheumatoid arthritis (RA) and healthy people and clinical significance. Methods The expressions of miRNAs in joint fluids of 3 RA patients and 3 healthy adults were detected by miRNA chip technology, and miRNAs with significant differential expressions were selected to be validated by the qRT-PCR. Correlations between selected miRNA and clinical and laboratory indexes of RA were analyzed. Results In the gene expression profile of miRNA in joint fluids of patients with RA, the expressions of 23 miRNAs significantly changed when compared with those in the healthy people. The results of selected miRNAs by qRT-PCR were correspond with the Results of the miRNA chip technology. The difference of miR-146a expression in joint fluid between RA patients and healthy controls was the most significant. Pearson correlation analysis showed that serum miR-146a expression in joint fluid of RA patients was positively correlated with rheumatoid factor (RF) value and DAS28 score. ROC curve analysis showed that the area under the curve (AUC) of miR-146a was 0.71, and the sensitivity and the specificity of miR-146a in joint fluid in predicting RA were 85.29% and 61.54% respectively. Conclusion There is significant difference in expression of miRNAs in joint fluid between RA patients and healthy people. Expression of miR-146a increases significantly in joint fluid of RA patients, and it level is significantly correlated with the clinical and laboratory indexes of RA.

rheumatoid arthritis; miRNA chip; joint fluid; miR-146a

2017-03-14

R 593.22

A

1672-2353(2017)13-051-05

10.7619/jcmp.201713014