幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A、细胞毒素相关蛋白E、细胞空泡毒素A基因型与上消化道疾病的关系

蒋闵仁, 黄 英, 宋佳鸿, 叶圆圆

(1. 同济大学附属第十人民医院 消化内科, 上海, 200072;2. 民航上海医院-瑞金医院古北分院消化内科, 上海, 200336)



幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A、细胞毒素相关蛋白E、细胞空泡毒素A基因型与上消化道疾病的关系

蒋闵仁1, 黄 英2, 宋佳鸿1, 叶圆圆1

(1. 同济大学附属第十人民医院 消化内科, 上海, 200072;2. 民航上海医院-瑞金医院古北分院消化内科, 上海, 200336)

目的 分析幽门螺杆菌(Hp)的细胞毒素相关蛋白A(cagA)、细胞毒素相关蛋白E(cagE)、细胞空泡毒素A(vacA)基因型与上消化道疾病的关系。方法 选取112例上消化道疾病患者，对其胃黏膜组织中Hp菌株的cagA、cagE、vacA基因型进行检测和分析。结果 所有患者胃黏膜样本中的Hp菌株均为cagA基因和cagE基因阳性表达，阳性率均为100%。患者的vacA s1/m2表型的阳性率最高，分别为54.1%和60.5%, 其次为vacA s1/mlb表型和vacA s1/m-表型，阳性率分别为13.2%～21.1%。消化性溃疡患者和慢性胃炎患者的Hp基因各表型的阳性率的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 上消化道疾病患者胃黏膜组织中的Hp菌株呈现cagA、cagE、vacA s1/m2等基因亚型的优势表达，说明这些毒力因子表型在Hp引发和促进上消化道疾病的过程中具有重要的作用，但与上消化道疾病类型缺乏相关性。

幽门螺杆菌; 细胞毒素相关蛋白A; 细胞毒素相关蛋白E; 细胞空泡毒素A; 基因分型; 上消化道疾病

幽门螺杆菌(Hp)于1983年首次从胃黏膜组织中分离，相关流行病学调查数据显示，全世界人群中有近50%感染Hp。大量研究[1]证实，Hp感染是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤、结直肠肿瘤、反流性食管炎等多种消化道疾病的致病因素之一。研究[2]还揭示Hp感染与心脑血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病等多种胃肠外疾病的相关性。Hp具有多种毒力因子，主要包括尿素酶、黏液酶、磷脂酶A、溶血素、细胞毒素相关蛋白A(cagA)和细胞空泡毒素A(vacA)等。近年来针对Hp菌株基因分型的研究[3]证实，Hp基因型的差异可导致不同毒性作用，从而导致临床疗效和预后的显著不同。因此，针对Hp基因型的识别和研究对于各种上消化道疾病的防治具有重要的意义。在Hp各类致病因子基因分型中，cagA、cagE、vacA基因分型是影响Hp致病性的重要因素[4]。本研究分析Hp菌株的cagA、cagE、vacA基因型与上消化道疾病的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月—2016年6月在医院就诊的慢性胃炎、胃十二指肠溃疡患者112例作为研究对象，其中消化性溃疡74例，慢性胃炎38例，均经胃镜下胃黏膜组织活检确诊。其中男61例，女51例，年龄为28～56岁，平均年龄为(42.1±6.8)岁。排除入组前15 d内应用过质子泵抑制剂、非甾体消炎药的患者，排除长期酗酒的患者，排除具有胃切除术史的患者，排除合并有重要器官器质性病变、心肝肾功能不全的患者。所有纳入患者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 检测方法

所有患者均于胃镜下钳取胃黏膜组织进行Hp快速尿素酶检测，并根据结果再次钳取胃黏膜进行Hp培养和病理检查，采样位置位于幽门部位5 cm处。Hp培养所得菌落经洗涤后，以8 000 r/min的速度离心5 min。提取DNA后采用PCR反应系统进行扩增，引物系列、反应体系、反应条件见表1, 扩增产物采用琼脂凝胶电泳在紫外灯下进行分析。PCR反应体系: 上游引物0.5 μL, 下游引物0.5 μL, PCR缓冲液2 μL, dNTPs 1.6 μL, TaqDNA聚合酶0.2 μL, 模板DNA 1 μL, 去离子水14.2 μL, 合计20 μL。PCR反应条件: 预变性94 ℃ 5 min, 变性94 ℃ 1 min, 退火55 ℃ 1 min, 延伸72 ℃ 6 min。

表1 目的基因的引物序列

1.3 统计学方法

应用SPSS 18.0 for Windows统计软件进行统计学分析，计数资料采用百分比的形式表示，采用卡方检验进行处理，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本组患者中，所有患者胃黏膜样本中的Hp菌株均为cagA基因和cagE基因阳性表达，阳性率均为100%。在vacA基因表型中，消化性溃疡患者和慢性胃炎患者的vacA s1/m2表型的阳性率最高，分别为54.1%和60.5%, 其次为vacA s1/mlb表型和vacA s1/m-表型，阳性率分别为13.2%～21.1%, 而其他表型的阳性率均较低，两类患者的Hp基因各表型的阳性率的差异均无统计学意义(χ2=0.400～1.965,P>0.05)，见表2。

表2 112例消化道疾病患者的Hp基因表达情况

3 讨 论

本研究结果显示，上消化道疾病患者胃黏膜中的Hp菌株全部为cagA基因和cagE基因阳性表达, vacA s1/m2的阳性率最高，其次为vacA s1/mlb表型和vacA s1/m-表型，但不同类型上消化道疾病患者的Hp基因各表型的阳性率差异并不明显，这体现了cagA、cagE、vacA s1/m2等Hp致病因子表型在Hp引发上消化道疾病的过程中均发挥着重要的作用，但在不同类型的上消化道疾病中并不存在显著差异。Hp菌株的cagA能够通过Ⅳ型分泌系统进入宿主细胞，通过对EMT相关的信号通路分子、miRNA-584、miRNA-1290等基因表达水平进行调节，从而调控胃上皮细胞形态、细胞间连接以及细胞凋亡等细胞相关生物学行为，最终导致胃黏膜组织的损害甚至是恶变，而cagA是由cagA基因编码产生[5-6]。

近年来的研究结果显示, Hp菌株的cagA表达水平及基因表型与上消化道疾病的发病具有相关性。马瑛泽等[7]的研究结果显示，胃十二指肠疾病Hp阳性感染者的cagA表达阳性率均明显高于健康对照人群, cagA的阳性表达与胃炎、胃十二指肠溃疡等疾病的发生密切相关。陈周利[8]的研究证实, cagA表达阳性的Hp感染上消化道疾病患者的血清IL-9水平要显著低于cagA表达阴性的患者，而IL-9可能对Hp感染所致的胃黏膜损害发挥抑制作用。谢兆兰等[9]的研究结果显示，Hp菌株cagA表达阳性的慢性胃炎患者的胃黏膜炎症程度更重，与cagA表达阴性的患者比较，此类患者的外周血中细胞因子IFN-γ、IL-17A等表达水平显著下降，而IL-4、TGF-β的表达水平显著上升。郭皓等[10]的研究结果显示, cagA表达阳性的Hp感染患者的血清IL-6、IL-8水平更高，cagA基因型与IL-6、IL-8有密切关系。罗昭逊等[11]的研究结果显示，对于甲硝唑耐药的Hp菌株的cagA基因阳性率为100%, 而且cagA基因在某些位点上存在共同突变，同时还具有较多的随机突变位点, cagA基因阳性是导致耐甲硝唑Hp菌株出现的主要原因之一。但郎轶萱等[12]的报道则显示, Hp耐药菌株与cagA表达阳性并不存在明显的相关性。vacA因能够导致胃上皮细胞空泡化而得名，随着针对其毒力作用的研究深入, vacA已被证实可引发促分裂原活化蛋白激酶激活、质膜通透性增加、极化上皮单层屏障功能下降、细胞凋亡增加、免疫功能紊乱等胃上皮细胞多重病理改变，但在有毒力的Hp菌株中vacA的转录水平和作用效能均存在着较大的差异，这与vacA基因的多态性具有密切的相关性[13]。杨卓等[14]的研究结果显示，VacA N端片段可诱导GES-1细胞凋亡及空泡样变，而VacA蛋白则可通过这一途径激活Caspase-9和Caspase-3从而发挥细胞损伤作用。田一玲等[15]的研究结果显示, Hp菌株对阿莫西林耐药与VacA基因型具有相关性。牛省利等[16]的研究证实，Hp菌株VacA m区基因型与胃溃疡患者对兰索拉唑三联疗法的反应性有关，能够作为预测治疗结局参考指标。

近年来，不少研究者针对Hp菌株的cagA、cagE、vacA基因分型情况进行了调查和监测，但结果并不完全一致。杜东龙等[17]针对威海地区临床分离Hp菌株的cagA基因的3′端多态性进行了监测，结果显示，威海地区的Hp cagA基因以东亚型为主，东、西方亚型Hp菌株都存在cagA基因3′端编码氨基酸序列的改变。张忠等[18]的研究结果显示，vac A s1/m2亚型是与慢性萎缩性胃炎相关Hp毒力菌株。姜成等[19]的研究结果显示，慢性胃痛患者的Hp菌株vacA基因以s1/m2亚型为主，而该类型Hp菌株感染增加了NF-κB P65蛋白的表达。戚艳丽等[20]针对洛阳地区Hp菌株的vacA基因亚型进行了监测和研究，结果显示，洛阳地区感染Hp的VacA阳性率近50%, 优势基因亚型为s1/m2, 但vacA亚型及亚型嵌合体的阳性率在不同胃肠疾病之间并不存在显著差异。胡素侠等[21]针对淮南地区Hp感染的个体菌株基因多态性及其对感染结局的影响进行了研究，结果显示，cagA表达阳性、vacAs表达阳性、iceA2表达阳性为淮南地区Hp感染的优势基因型，该基因型会增加Hp根除失败的风险。张双红等[22]针对江西地区胃十二指肠疾病儿童感染的临床分离Hp菌株的cag A、vac A和ice A基因亚型的研究结果显示，该地区胃十二指肠疾病患儿感染的Hp优势基因亚型是cagA、vacA s1/m2和ice A1，而且存在不同基因型HP菌株的混合感染，但Hp基因亚型与胃十二指肠疾病类型无相关性。阿孜尔古丽·阿布都克日木等[23]对新疆维吾尔族和汉族患者的Hp分离株cagA、vacA基因型与上消化道疾病的相关性进行了分析，研究结果显示，维吾尔族胃癌患者的vacA m2基因型检出率显著高于汉族患者，而vacA m1b基因型检出率则较低，两个民族研究对象的vacA m1b基因型检出率从高到低的排列次序均为慢性胃炎、胃溃疡和胃癌。秦丹等[24]针对贵阳地区儿童Hp感染临床分离菌株的cagA基因和vacA基因表达研究结果显示，该地区儿童HP感染菌株的cagA基因阳性率超过了80%，vacA基因亚型的优势基因为vacA s1/m2型，但毒力基因与疾病的种类和Hp针对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星等抗菌药物的耐药性增强均无明显的相关性[25-27]。总之，不同地区和种族的Hp菌株的毒力因子基因表型存在着一定的差异，但其基因表型与疾病种类、耐药性的相关性尚需进一步的临床研究予以讨论。

综上所述，上消化道疾病患者胃黏膜组织中的Hp菌株呈现cagA、cagE、vacA s1/m2等基因亚型的优势表达，说明这些毒力因子表型在Hp引发和促进上消化道疾病的过程中具有重要的作用，但与上消化道疾病类型缺乏相关性。

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Relationship between cytotoxic associated protein A,cytotoxic associated protein E, vacuolating cytotoxin A genotypes of Helicobacter pylori and upper digestive tract diseases

JIANG Minren1, HUANG Ying2, SONG Jiahong1, YE Yuanyuan1

(1.DepartmentofDigestiveMedicine,TheTenthPeople′sHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai, 200072; 2.DepartmentofDigestiveMedicine,TheGubeiBranchofRuijinHospital,Shanghai, 200336)

Objective To explore the relationship between cytotoxin associated protein A (cagA), cytotoxin associated protein E(cage), vacuolating cytotoxin A (vacA) genotypes of Helicobacter pylori (Hp) and the upper digestive tract diseases. Methods A total of 112 patients with upper gastrointestinal diseases were selected. The cagA, cagE, vacA genotypes of Hp strains in gastric mucosa of the patients were detected and analyzed. Results All Hp strains in the gastric mucosa samples of patients were found with both cagA gene and cagE gene expression, and the positive rate was 100%. The positive rates of vacA s1/m2 genotype in the patients were the highest with 54.1% and 60.5% respectively, followed by the vacA s1/mlb genotype and vacA s1/m- phenotypes, and the positive rates were from 13.2% to 21.1%. The differences of positive rates of each genotypes in Hp genes between the patients with peptic ulcer and chronic gastritis were not significant (P>0.05). Conclusion Hp strains in gastric mucosa patients with upper gastrointestinal diseases show the advantage expressions of cagA, cagE, vacA s1/m2 subtypes, which refers that such virulence phenotypes may play important roles in initiation and promotion process of upper gastrointestinal diseases by Hp, but the correlation with the type of upper digestive tract diseases is not proved.

Helicobacter pylori; cytotoxic associated protein A; cytotoxic associated protein E; vacuolating cytotoxin A; genotypes; upper gastrointestinal diseases

2017-03-11

黄英, E-mail: 524370434@qq.com

R 573

A

1672-2353(2017)13-036-04

10.7619/jcmp.201713010