表没食子儿茶素没食子酸酯对同型半胱氨酸促血管平滑肌细胞增殖的保护作用

战晓丽, 周东池, 顾惠芳, 杨秀红, 金惠敏

(上海市浦东医院 肾脏内科, 上海, 201399)



表没食子儿茶素没食子酸酯对同型半胱氨酸促血管平滑肌细胞增殖的保护作用

战晓丽, 周东池, 顾惠芳, 杨秀红, 金惠敏

(上海市浦东医院 肾脏内科, 上海, 201399)

目的 观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在同型半胱氨酸(Hcy)促血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中的保护作用。方法 采用不同的实验试剂培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs), 分为对照组(control)、Hcy组(Hcy 100、200、500、1 000 μmol/L)、EGCG组(EGCG 5、10、20 μmol/L)、Hcy+EGCG组(Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L), 在培养的24 h, 采用CCK-8法、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法观察细胞增殖情况; 酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血管紧张素Ⅱ(AngII)浓度, Western印迹法测定AngII受体1(AT-1R)蛋白表达水平。结果 干预24 h后，与对照组相比, Hcy各组细胞增殖均显著增加(P<0.05), EGCG 10、20 μmol/L组细胞增殖显著减少(P<0.05); 与Hcy 500 μmol/L组相比，加入EGCG 10、20 μmol/L干预后细胞增殖显著减少(P<0.01), AngII浓度及AT-1R蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论 EGCG可抑制Hcy诱导的VSMCs增殖。

同型半胱氨酸; 表没食子儿茶素没食子酸酯; 增殖; 血管紧张素Ⅱ; 血管紧张素Ⅱ1型受体

流行病学调查[1-2]显示，慢性肾脏病(CKD)的发病率越来越高，已经成为全球性的公共卫生问题。心血管疾病(CVD)是CKD患者的主要死因，严重影响CKD患者预后[3]。血管平滑肌细胞(VSMCs)是血管壁的主要组成成分，其过度增殖是CVD的重要危险因素[4-5], 而肾素-血管紧张素系统(RAS)与细胞增殖密切相关[6-7]。同型半胱氨酸(Hcy)作为CKD患者CVD的一种非传统危险因素受到人们的关注，体外高Hcy状态下培养VSMCs可促进其增殖。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中的主要活性成分，其抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗细胞增殖等多种生物学效应的研究是热点。本研究观察EGCG对Hcy促HASMCs增殖的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人主动脉血管平滑肌细胞株(HASMCs)由上海市复旦IBS细胞库提供。胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶购自美国Gibco公司。EGCG(纯度≥95%)、Hcy(纯度≥95%)、奥美沙坦(Olmesartan，纯度≥98%)、4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自美国Sigma公司。CCK8试剂盒购自日本同仁(Dojindo)。BrdU、BrdU抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，红色荧光Alexa fluor594购自美国thermo fisher scientific。人AngII ELISA试剂盒、抗AT-1R抗体购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养: HASMCs置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，所用培养基为4.5 g/L葡萄糖DMEM培养基，添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素。在干预之前，将细胞置于含0.1%FBS培养基中饥饿24 h。

1.2.2 细胞增殖的检测: ① CCK-8法。HASMCs常规培养后消化传代，用培养液调整细胞密度为1.0×104/mL, 取对数生长期细胞接种于96孔板(每孔100 μL), 待细胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培养基饥饿24 h。换用不同试剂干预24 h(加入EGCG、Olmesartan或者二者预处理时，先加入上述相应浓度的试剂孵育30 min, 再加入Hcy使其达到所需终浓度)，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，轻轻震摇培养板，置培养箱中继续孵育3 h, 于450 nm测吸光度(OD值)。② BrdU标记法: HASMCs常规培养后消化传代，取对数生长期细胞接种于24孔板(每孔1.0×104个细胞)，待细胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培养基饥饿24 h。加入不同试剂孵育，同时加入BrdU(终浓度为10 μmol/L)。干预24 h后, 4%多聚甲醛固定，加入2 mol/L的HCl室温下放置1 h, 0.1 mol/L硼酸处理15 min, 0.1%Triton X-100通透2 min、10%BSA封闭1 h, 加入抗-BrdU抗体4 ℃过夜，再加入Alexa Fluor 594荧光二抗(显示为红色荧光，激发波590 nm/发射波617 nm)、室温下孵育1 h, 以上各步之间均用PBS洗涤3次。最后DAPI染色10 min, PBS洗涤3次。显微镜下观察并拍照，每组选取5个不同视野计数，计算LI(LI=BrdU阳性细胞数/总细胞数)。③ ELISA测定AngII浓度: HASMCs常规培养后消化传代，待细胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培养基饥饿24 h。换用Hcy+EGCG干预24 h, 收集细胞培养基4 ℃ 3 000×g离心10 min, 收集细胞上清液，分装于EP管中, -20 ℃保存备用。细胞上清液AngII的检测使用人AngII ELISA试剂盒。④ Western印迹法测定AT-1R蛋白表达水平: HASMCs常规培养后消化传代，待细胞70%～80%融合后，含0.1%FBS培养基饥饿24 h。换用Hcy+EGCG干预24 h, 收集细胞常规提取蛋白，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE, 每孔上样量为30 μg总蛋白)，将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜, 5%脱脂牛奶室温封闭1 h, PVDF膜和所需抗体孵育4 ℃过夜, TBST洗3次，室温孵育二抗1 h, TBST洗3次，化学发光显影。所有实验重复3遍，应用SPSS 22.0统计软件包进行统计分析。

2 结 果

2.1 EGCG对HASMCs增殖的影响

2.1.1 CCK-8法：不同试剂干预24 h, 结果显示，与对照组相比, Hcy组OD值均显著增加(P<0.05), 且Hcy 500、1 000 μmol/L时OD值增加更显著(P<0.01); 与对照组相比, EGCG 5 μmol/L组OD值无显著下降(P>0.05), EGCG 10、20 μmol/L组OD值均显著下降(P<0.05), 且EGCG 20 μmol/L时OD值下降更显著(P<0.01); 与Hcy 500 μmol/L组相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干预后，其OD值均显著下降(P<0.01)。在本实验中，作者还加入了Olmesartan，结果发现，与Hcy 500 μmol/L组相比, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L组OD值均显著下降(P<0.01), 但前二者无显著差异(P>0.05); 而与Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L组相比, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L组OD 值均显著增加(P<0.05); 提示在Hcy诱导的VSMC增殖中, EGCG与Olmesartan均可抑制细胞增殖，且二者有叠加效应。见表1。

2.1.2 BrdU标记法：不同试剂干预24 h, 结果显示，与对照组相比, Hcy组LI均显著增加(P<0.05), 且Hcy 200、500、1 000 μmol/L时LI增加更显著(P<0.01); 与对照组相比, EGCG 5 μmol/L组LI无显著下降(P>0.05), EGCG 10、20 μmol/L组LI均显著下降(P<0.01); 与Hcy 500 μmol/L组相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干预后，其LI均显著下降(P<0.01)。作者也加入了Olmesartan, 结果发现，与Hcy 500 μmol/L组相比, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L +EGCG 20 μmol/L组LI均显著下降(P<0.01), 但前二者无显著差异(P>0.05); 与Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L组相比, Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L组LI显著增加(P<0.05); 提示在Hcy诱导的VSMC增殖中, EGCG与奥美沙坦均可抑制细胞增殖，且二者有叠加效应。见表2。

表1 HASMCs的增殖情况(OD值)

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;

与Hcy 500 μmol/L比较, ##P<0.01;

与Hcy 500 μmol/L+Olmesartan 1 μmol/L+EGCG

20 μmol/L比较, △P<0.05。

表2 HASMCs的增殖情况(LI)

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;

与Hcy 500 μmol/L比较, ##P<0.01; 与Hcy 500 μmol/L+Olmesartan

1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L比较, △P<0.05。

2.2 EGCG对AngII浓度的影响

Hcy 500 μmol/L+不同浓度EGCG(Hcy 500 μmol/L+EGCG5 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L)干预24 h, 收集细胞上清液，ELISA法测定AngII浓度。结果显示，与Hcy 500 μmol/L组相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干预后AngII浓度显著降低(P<0.01), 但2组间无显著差异(P>0.05)。见图1。

control是指对照组;Hcy、EGCG浓度均为μmol/L。与Hcy500μmol/L比较,**P<0.01图1 EGCG对局部AngII浓度的影响

2.3 EGCG对AT-1R蛋白表达的影响

Hcy 500 μmol/L+不同浓度EGCG(Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L、Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L)干预24 h, 结果显示，与Hcy 500 μmol/L组相比，加入EGCG(10、20 μmol/L)干预后AT-1R蛋白表达水平显著降低(P<0.01), 但是2组间无显著差异(P>0.05)。见图2。

A: AT-1R、GAPDH的Western印迹条带图; B: AT-1R蛋白定量分析图; control是指对照组; Hcy是指Hcy浓度为500 μmol/L; Hcy+EGCG5是指Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L; Hcy+EGCG 10是指Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L;Hcy+EGCG 20是指Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L。与Hcy 500 μmol/L比较, **P<0.01

图2 EGCG对AT-1R蛋白表达水平的影响

3 讨 论

CVD是CKD患者主要并发症之一，已成为CKD患者的主要死因，严重影响CKD患者的预后[3]。VSMCs是血管壁的主要成分，其过度增殖是CVD的重要因素[4- 5]。CKD患者发生CVD的危险因素有很多，除了传统危险因素如吸烟、糖尿病、高血压、高血脂等, Hcy作为一种非传统危险因素越来越受到人们的关注[8-9]。

Hcy属于甲硫氨酸的代谢中间产物，血浆Hcy范围在5～10 μmol/L, 正常状态下, Hcy浓度不超过15 μmol/L, 血浆Hcy水平升高定义为高同型半胱氨酸血症(hHcy)[10]。CKD患者中普遍存在Hcy水平异常，据报道85%～90%CKD患者Hcy升高[9]。研究[11-12]表明, CKD患者中Hcy水平升高预示着心血管不良事件。Hcy水平升高引起CVD的发病机制目前并不十分清楚，认为可能与以下几方面有关：血管内皮损伤及功能障碍、破坏凝血和纤溶平衡、脂质代谢异常、促进VSMCs增殖、免疫系统如单核细胞的激活等。其中，有关Hcy诱导VSMCs增殖的研究已引起越来越多学者的兴趣。Tang等[13]报道, Hcy(500～1 000 μmol/L)孵育人脐动脉平滑肌细胞24 h后，可引起VSMCs增殖呈浓度依赖性增加。本研究发现, Hcy(100、200、500、1 000 μmol/L)呈剂量依赖方式诱导VSMCs增殖, Hcy 500 μmol/L时其促增殖效应达峰值。

绿茶是世界上最受欢迎的饮品之一，它具有多种生物学效应，在许多疾病防治方面发挥重要作用，如肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病、脑血管疾病及神经系统变性疾病等[14]。研究[15-18]发现，大量摄入绿茶可明显降低CVD风险, EGCG作为绿茶的主要活性成分，对心血管系统具有重要的保护作用。EGCG可抑制VSMCs增殖，但是EGCG是否可抑制Hcy诱导的VSMCs增殖及其相关机制目前仍未有研究。本实验结果表明, EGCG(10、20 μmol/L)可抑制VSMCs增殖，且EGCG(10、20 μmol/L)可抑制Hcy 500 μmol/L诱导的VSMCs增殖，差异有统计学意义(P<0.01)。

CKD与CVD均与RAS有着密切关系。AngII是RAS中的重要成员之一，它与AT-1R结合后引起血管收缩、促进细胞增殖、炎症、氧化应激等多种生物学效应。为了研究EGCG发挥作用是否与局部RAS有关，作者加入了AT-1R阻断剂-奥美沙坦，再采用CCK-8和BrdU两种方法观察VSMCs增殖情况。结果发现，与Hcy 500 μmol/L组相比，加入奥美沙坦1 μmol/L阻断AT-1R后，其OD值、LI均显著下降(P<0.01)，而与Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L和Hcy 500 μmol/L+Olmesarsan 1 μmol/L组相比, Hcy 500 μmol/L+Olmesarsan 1 μmol/L+EGCG 20 μmol/L组OD值、LI显著下降(P<0.05), 提示EGCG与奥美沙坦均可抑制细胞增殖，二者发挥类似作用，且二者有叠加效应。作者采用ELISA的方法测定VSMCs培养上清液中AngII的浓度，采用Western印迹法测定VSMCs中AT-1R蛋白表达水平。研究发现，加入EGCG(10、20 μmol/L)干预后可抑制VSMCs分泌AngII, 可下调VSMCs中AT-1R蛋白表达水平，与Hcy 500 μmol/L组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。

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Protective effects of epigallocatechin gallate on homocysteine-induced proliferation of vascular smooth muscle cells

ZHAN Xiaoli, ZHOU Dongchi, GU Huifang, YANG Xiuhong, JIN Huimin

(DepartmentofNephrology,ShanghaiPudongHospital,Shanghai, 201399)

Objective To observe the protective effect of epigallocatechin gallate (EGCG) on homocysteine-induced proliferation of human aortic smooth muscle cells (HASMCs). Methods HASMCs were served as objects, which were cultured in various media, including Hcy (100, 200, 500, 1 000 μmol/L), EGCG (EGCG 5, 10, 20 μmol/L), Hcy+EGCG (Hcy 500 μmol/L+EGCG 5 μmol/L, Hcy 500 μmol/L+EGCG 10 μmol/L, Hcy 500 μmol/L+EGCG 20 μmol/L) for 24 h. The proliferation of HASMCs was determined by cell counting kit-8 (CCK-8) and bromodeoxyuridine (BrdU) labeling. The level of angiotensin Ⅱ(AngII) was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the level of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT-1R) was determined by Western blot. Results After treatment for 24 h, compared with the control group, the proliferation of cells in different Hcy groups significantly increased (P<0.05), while the proliferation of cells in EGCG 10 and 20 μmol/L group significantly reduced (P<0.05). Compared with the Hcy 500 μmol/L group, cell proliferation significantly reduced after adding EGCG 10 and 20 μmol/L (P<0.01), while the expression levels of AngII and AT-1R decreased significantly (P<0.01). Conclusion EGCG can inhibit Hcy-induced proliferation of VSMCs.

homocysteine; epigallocatechin gallate; proliferation; angiotensinII; angiotensin Ⅱ type 1 receptor

2017-01-22

上海市浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养资助项目(PWRq2014-05);

金惠敏

R 654.3

A

1672-2353(2017)13-017-05

10.7619/jcmp.201713005

上海市医学重点专科建设项目(ZK2015A15); 上海市浦东新区卫生系统重点学科建设项目(PWZx2014-11);

上海市浦东新区医学领先人才项目(PWRI2012-05)