干扰表皮生长因子受体表达对脑出血后星形胶质细胞活化的影响及其机制

伍正彬, 罗大林, 蒋东坡

(1. 重庆市东南医院 ICU, 重庆, 401336; 2. 第三军医大学附属第三医院 重症医学科, 重庆, 400042)



干扰表皮生长因子受体表达对脑出血后星形胶质细胞活化的影响及其机制

伍正彬1, 罗大林2, 蒋东坡2

(1. 重庆市东南医院 ICU, 重庆, 401336; 2. 第三军医大学附属第三医院 重症医学科, 重庆, 400042)

目的 观察干扰表皮生长因子受体(EGFR)表达对脑出血后星形胶质细胞活化的影响。方法 注射Ⅶ型胶原酶制备脑出血模型大鼠，同时设置假手术组作为对照。术后7 d, 行神经功能评分判断造模成功与否。取脑出血模型大鼠和假手术大鼠，行SP免疫组化法检测脑组织EGFR和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。分离新生大鼠皮层星形胶质细胞，体外培养。观察干扰EGFR表达对细胞的影响，实验分4组: ① 对照组：不处理; ② 重组大鼠睫状神经营养因子(CNTF)组：加入20 μg/L CNTF; ③ 阴性组：加入20 μg/L CNTF, 并转染EGFR siRNA阴性对照; ④ EGFR组：加入20 μg/L CNTF, 并转染EGFR siRNA。采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测各组细胞EGFR、GFAP、磷酸化酪胺酸激酶JAK1(p-JAK1)、磷酸化信号传导与转录激活因子3(p-STAT3)的表达。结果 脑出血模型大鼠造模成功率89.5%(17/19)。脑出血模型大鼠脑组织EGFR和GFAP表达显著高于假手术组(P<0.05)。EGFR组EGFR mRNA和蛋白相对表达量显著低于对照组、CNTF组和阴性组(P<0.05)。CNTF组和阴性组GFAP mRNA和蛋白相对表达量显著高于对照组和EGFR组(P<0.05), 而对照组和EGFR组比较无显著差异(P>0.05)。 CNTF组和阴性组p-JAK1和p-STAT3蛋白相对表达量显著高于对照组和EGFR组(P<0.05), 而对照组和EGFR组比较无显著差异(P>0.05)。结论 脑出血大鼠EGFR和GFAP表达升高，星形胶质细胞活化。干扰EGFR表达可抑制大鼠星形胶质细胞活化，其机制可能与阻滞JAK1和STAT3磷酸化有关。

表皮生长因子; 神经胶质纤维酸性蛋白; 磷酸化酪胺酸激酶JAK1; 磷酸化信号传导与转录激活因子3;星形胶质细胞

脑出血是ICU常见的危急重症之一，死亡率和致残率极高，不仅严重影响患者生命健康和生活质量，还给家庭和社会造成沉重的经济负担[1]。脑出血后继发的脑损伤是导致患者预后不良的主要因素之一，这种继发性损伤机制相当复杂，众多学者也做了大量研究，但其具体机制尚不十分明确。近年来有研究[2-3]认为，星形胶质细胞活化在脑出血后继发性脑损伤过程中扮演重要角色，是引起继发性脑损伤的重要效应细胞。有研究[4]发现，中风、颅脑损伤等中枢神经系统损伤患者，脑组织中表皮生长因子受体(EGFR)表达显著增加，且大多表达在活化的星形胶质细胞中，推测EGFR可能在星形胶质细胞活化过程中发挥作用。本研究通过构建脑出血模型大鼠和体外培养大鼠皮层星形胶质细胞，观察EGFR对脑出血后星形胶质细胞活化的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

Sprague-Dawley健康大鼠40只, 3 d以内的新生大鼠10只，均购自中国科学院北京斯莱克实验动物中心(SCXK京2011-0012)。新生大鼠购回次日即用于皮层星形胶质细胞分离，其他大鼠购回后适应性饲养2周后再用于实验。SP免疫组织化学检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠EGFR、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、磷酸化酪胺酸激酶JAK1(p-JAK1)、磷酸化信号传导与转录激活因子3(p-STAT3), 以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa Cruz公司。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素双抗均购自美国Gibco公司。EGFR siRNA及其阴性对照核苷酸序列均委托上海吉玛制药技术有限公司设计合成。EGFR siRNA上游: 5′-CCUUAGCAGUCUUAUCUAATDT-3'; 下游: 5′-dTdTGGAAUCGUCAGAAUAGAUU-3′。阴性对照上游: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′; 下游: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。重组大鼠睫状神经营养因子(CNTF)购自美国R&D Systems公司。Lipofectamine 2000转染试剂、TRIzol总RNA提取试剂均购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自美国ABI Applied Biosystems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脑出血模型大鼠制备：制备脑出血模型大鼠共20只。参照文献[5]标准, 10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，俯卧固定于鼠脑立体定向仪上。参照鼠脑立体定位仪图谱，开一骨窗，通过微量注射器注入2 μL的Ⅶ型胶原酶(0.20 U/μL), 逐层缝合伤口，抗生素预防感染，自然苏醒后常规饲养。同时取20只大鼠行同样的开骨窗操作，注入等量生理盐水，其余操作相同，作为假手术组。术后7 d, 采用Bederson评分法行神经功能评分以判断造模是否成功。0分：神经功能无缺失; 1分：提尾倒挂时损伤对侧前肢屈曲; 2分：前肢屈曲及对侧抵抗推力下降; 3分：向对侧转圈; 4分：向对侧转圈及意识障碍。1～3分视为造模成功。

1.2.2 免疫组化检测EGFR和GFAP表达：脑出血模型大鼠和假手术大鼠各10只，取脑组织, 10%中性甲醛固定，石蜡包埋, 4 μm连续切片。行SP免疫组化法检测EGFR和GFAP表达。具体步骤: 4 μm组织切片, 60 ℃烤片2 h, 二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化; 37 ℃的3% H2O2溶液孵育10 min, 柠檬酸高压抗原修复法修复; PBS洗净，加入兔抗大鼠一抗(抗GFAP、抗EGFR)工作液, 4 ℃孵育24 h; PBS洗净，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗工作液, 37 ℃孵育30 min; 显色剂显色，苏木素复染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，最后封片。根据阳性细胞比例和染色程度行半定量分析[6]: 阳性细胞比例<5%、5%～24%、25%～50%、51%～74%、>75%, 分别计为0、1、2、3、4分; 无、弱、中、强染色，分别计为0、1、2、3分。综合两项计分之和: 0分阴性(-), 1～2分弱阳性(+), 3～5分中度阳性(2+), 6～7分强阳性(3+)。

1.2.3 大鼠皮层星形胶质细胞分离培养: 3 d以内的新生大鼠5只，取大脑皮层组织，剪碎成小块, 0.25%胰蛋白酶消化30 min, 胎牛血清终止消化, 1 000 r/min离心5 min, 弃去上层液体，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液, 100目筛网过滤，调整细胞密度至4×108个/L，转移至细胞培养瓶, 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。隔3 d更换培养液，细胞生长至85%融合时, 0.25%胰酶消化、传代。收集处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.4 EGFR siRNA转染实验分组与处理：处于对数生长期的星形胶质细胞接种于6孔板，实验分4组: ① 对照组：正常培养，不处理; ② CNTF组：加入20 μg/L的CNTF; ③ 阴性组：加入20 μg/L的CNTF, 并转染EGFR siRNA阴性对照; ④ EGFR组：加入20 μg/L的CNTF, 并转染EGFR siRNA。转染方法: EP管中配置转染A液(EGFR siRNA或其阴性对照各100 μL+无血清DMEM培养基100 μL), 转染B液(Lipofectamine 2000 5 μL+无血清DMEM培养基100 μL)。混合A、B液，室温静置20 min。取出正常培养的星形胶质细胞，弃去原培养液，加入A/B混合液。孵育6 h，弃去转染液，更换为含10%胎牛血清的正常培养液继续培养。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测mRNA表达：收集各组细胞, TRIzol法提取细胞总RNA, 核酸蛋白分析仪进行RNA质量评估，若A260/A280为1.8～2.0, 则满足实验要求。按反转录试剂盒操作反转录成合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，引物委托上海吉玛制药技术有限公司设计合成。EGFR上游: 5′-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3′; 下游: 5′-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3′。GFAP上游: 5′-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3′; 下游: 5′-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3′。GAPDH 上游: 5′-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3′; 下游: 5′-ATGCCTGCTTCACCACCACCTTG -3′。扩增条件: 94 ℃ 3 min, 94 ℃ 1 min, 61 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共35个循环, 72 ℃ 7 min。采用2-△△Ct计算目的基因相对含量(RQ), RQ=2-△△Ct。

1.2.6 蛋白印迹法检测蛋白表达：收集各组细胞，冰浴下加RIPA细胞裂解液。裂解30 minG 转移至离心管G 4 ℃下10 000 r/min离心5 min, 取上清蛋白液。BCA法测定蛋白浓度, -20 ℃保存备用。100μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜。TBST漂洗, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 兔抗大鼠一抗(抗EGFR、抗GFAP、抗p-JAK1、抗p-STAT3)工作液, 4 ℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗工作液, 37 ℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室内ECL显色、曝光。Band Scan 5.0软件分析条带光密度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白光密度值/内参β-actin光密度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件分析所有数据，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用One-way ANOVO单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验。等级资料的比较采用秩和检验。取双侧α<0.05为检测水准，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑出血模型大鼠脑组织EGFR和GFAP表达

造模大鼠共20只，造模7 d后，因伤口感染死亡1只。剩余19只行神经功能评分证实造模成功17只，造模成功率89.5%(17/19)。取脑出血模型大鼠和假手术大鼠各10只，行免疫组化检测。脑出血模型大鼠脑组织胶质细胞的胞质中，分布大量黄色至棕黄色的EGFR和GFAP阳性颗粒(图1-②, 图1-④), 假手术组大鼠仅见少量表达(图1-①, 图1-③)。半定量分析结果表明，脑出血模型大鼠脑组织EGFR和GFAP表达显著高于假手术组(P<0.05), 见表1。GFAP是星形胶质细胞的特异性标志物，其表达增加说明脑出血模型大鼠星形胶质细胞活化。

①:假手术组大鼠脑组织EGFR表达;②:脑出血模型大鼠脑组织EGFR表达;③:假手术组大鼠脑组织GFAP表达;④:脑出血模型大鼠脑组织GFAP表达图1 免疫组化检测假手术组和脑出血模型组大鼠EGFR和GFAP表达(200倍)

表1 手术组和脑出血模型组大鼠EGFR和GFAP表达

与假手术组比较, *P<0.05。

2.2 EGFR siRNA对EGFR表达的影响

与对照组、CNTF组和阴性组比较, EGFR组细胞EGFR mRNA和蛋白相对表达量分别下降91%和87%, 差异有统计学意义(P<0.05); 而对照组、CNTF组和阴性组比较无显著差异(P>0.05)。说明EGFR siRNA可显著抑制星形胶质细胞EGFR表达，满足后续实验要求。见图2。

与对照组、CNTF组和阴性组, *P<0.05

图2 实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测EGFR mRNA和蛋白表达

2.3 干扰EGFR表达对星形胶质细胞活化的影响

与对照组比较, CNTF组和阴性组细胞GFAP mRNA和蛋白相对表达量显著增加(P<0.05), 而CNTF组和阴性组比较无显著差异(P>0.05)。与CNTF组和阴性组比较, EGFR组细胞GFAP mRNA和蛋白相对表达量显著减少(P<0.05), 且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。GFAP是星形胶质细胞的特异性标志物，其表达增加说明CNTF可明显活化星形胶质细胞，而干扰EGFR表达可抑制CNTF引起的星形胶质细胞活化。见图3。

与对照组比较, *P<0.05;与CNTF组和阴性组比较, #P<0.05

图3 实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测GFAP mRNA和蛋白表达

2.4 干扰EGFR表达对p-JAK1和p-STAT3表达的影响

与对照组比较, CNTF组和阴性组细胞p-JAK1和p-STAT3蛋白相对表达量显著增加(P<0.05), 而CNTF组和阴性组比较无显著差异(P>0.05)。与CNTF组和阴性组比较, EGFR组细胞p-JAK1和p-STAT3蛋白相对表达量显著减少(P<0.05), 且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。说明星形胶质细胞活化可能与JAK1和STAT3磷酸化有关，而干扰EGFR表达可阻滞JAK1和STAT3磷酸化。见图4。

与对照组比较,*P<0.05;与CNTF组和阴性组比较,#P<0.05图4 蛋白印迹法检测p-JAK1和p-STAT3蛋白表达

3 讨 论

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，对神经元具有支持和滋养的作用。近年来，有关星形胶质细胞在中枢神经系统损伤或病变过程中的作用研究备受青睐。通常情况下星形胶质细胞存在静止和活化两种细胞形态，而脑出血发生时，其迅速从静止态转变为活化态。一般认为活化的星形胶质细胞具有双重作用[7-8]: 一方面，脑出血损伤早期，通过分泌多种细胞因子和神经营养因子，增强神经元对缺血、缺氧的耐受能力，从而保护神经元; 另一方面，过度增殖形成的胶质瘢痕阻碍轴突的再生、延长和融合; 胶质瘢痕还可压迫微血管，影响脑组织局部血液供应，造成继发性损伤。多数学者[9]认为，脑出血后活化的星形胶质细胞对神经元的损伤作用大于其保护作用，被认为是引起脑出血后继发性脑损伤的关键因素之一。GFAP是一种仅见于星形胶质细胞的Ⅲ型中间丝状蛋白，参与细胞骨架的构成。Gomes等[10]研究证实，星形胶质细胞的活化伴随着GFAP表达的显著上调，可认为GFAP是星形胶质细胞活化的特异性标志物。本研究也采用观察GFAP表达的变化作为判断星形胶质细胞活化的指标，结果显示，脑出血模型大鼠脑组织GFAP的表达显著高于假手术组，这与肖霖等[11]和钱红等[12]研究结果基本一致。说明脑出血后静态的星形胶质细胞转化为活化的星形胶质细胞，而这种转化在脑出血后继发性脑损伤中发挥重要作用。

如何有效抑制脑损伤后星形胶质细胞活化，对于促进脑损伤后神经功能恢复，减少继发性脑损伤，改善患者预后，降低死亡率和致残率等方面具有重要价值。研究[13]显示, EGFR 及其下游信号转导途径在脑损伤后星形胶质细胞活化中发挥作用。JAKs-STATs是 EGFR 常见的下游信号转导途径, EGFR与其配体结合后形成磷酸化的EGFR, 继而诱导其下游JAKs 磷酸化，并进一步诱导STATs磷酸化。磷酸化的STAT进入细胞核内与靶基因结合，从而调控靶基因的转录。既往对于JAKs-STATs信号转导途径的研究多着眼于肿瘤方面。如Thompson等[14]研究证实, JAKs-STATs信号转导途径抑制剂AG490能有效抑制肝癌细胞的生长。Leung等[15]报道, JAKs-STATs信号转导途径参与了星形胶质细胞的增殖、分化过程。Bright等[16]研究发现, JAKs-STATs信号转导途径参与了星形胶质细胞的活化，加剧了神经元损伤，阻碍神经功能恢复。

本研究采用EGFR siRNA干扰EGFR表达，结果发现EGFR表达显著降低。本研究随后用CNTF处理体外培养大鼠星形胶质细胞。结果发现, CNTF能显著上调细胞GFAP表达，而EGFR siRNA完全抑制了CNTF诱导的GFAP表达。说明CNTF可明显活化星形胶质细胞，而干扰EGFR表达可抑制CNTF引起的星形胶质细胞活化。为了进一步探讨EGFR抑制星形胶质细胞活化的相关机制，本研究进一步检测了各组细胞p-JAK1和p-STAT3的表达。结果发现, CNTF在上调GFAP表达的同时显著上调了JAK1和STAT3的表达，而EGFR siRNA可显著抑制CNTF介导的JAK1和STAT3表达。说明干扰EGFR表达抑制星形胶质细胞活化可能与阻滞JAK1和STAT3磷酸化有关。

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Effects of EGFR interference on activation of astrocytes after intra-cerebral hemorrhage and its mechanism

WU Zhengbin1, LUO Dalin2, JIANG Dongpo2

(1.ICU,ChongqingSoutheastHospital,Chongqing, 401336; 2.DepartmentofCriticalCareMedicine,TheThirdHospitalAffiliatedtoTheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400042)

Objective To investigate the effects of epidermal growth factor receptor (EGFR) interference on activation of astrocytes after intra-cerebral hemorrhage and its mechanism. Methods Rat model of intra-cerebral hemorrhage was induced by injection of Ⅶ collagenase. Sham operation group was set as control. After 7 d, the neurological function score was used to judge whether the model was successful or not. The expression of EGFR and GFAP in brain tissue of rats in intra-cerebral hemorrhage group and sham operation group were detected by SP immunohistochemical method. Astrocytes were isolated from newborn rats' cerebral cortex and cultured in vivo. Effects of EGFR interference on activation of astrocytes were observed. The experimental rats were divided into 4 groups: ① control group was not handled. ② CNTF group was added with 20 μg/L CNTF. ③ Negative group was added with 20 μg/L CNTF, and EGFR siRNA negative control was transfected. ④ EGFR group was added with 20 μg/L CNTF, and EGFR siRNA was transfected. The expressions of EGFR, GFAP, p-JAK1, p-STAT3 were detected by real-time PCR and Western blot. Results The modeling success rate was 89.5%(17/19). The expressions of EGFR and GFAP in brain tissue of rats with intra-cerebral hemorrhage were significantly higher than those in sham operation group (P<0.05). The relative expressions of EGFR mRNA and protein in EGFR group were significantly lower than those in control group, CNTF group and negative group (P<0.05). The relative expressions of GFAP mRNA and protein in the CNTF group and the negative group were significantly higher than those in the controlgroup and the EGFR group (P<0.05), but there was no significant difference between the control group and the EGFR group (P>0.05). The relative expressions of p-JAK1 and p-STAT3 protein in the CNTF group and the negative group were significantly higher than those in the control group and the EGFR group (P<0.05), but there was no significant difference between the control group and the EGFR group (P>0.05). Conclusion The expressions of EGFR and GFAP significantly increase in the rats with intra-cerebral hemorrhage. Interference of EGFR expression can inhibit the activation of astrocytes in rats, which may be related with the inhibition of JAK1 and STAT3 phosphorylation.

epidermal growth factor; glial fibrillary acidic protein; phosphorylated tyrosine kinase JAK1; phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3; astrocytes

2016-12-20

重庆市科学技术厅项目(0800160365)

罗大林

R 743.34

A

1672-2353(2017)13-012-05

10.7619/jcmp.201713004