番茄红素对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

赵孟雷

番茄红素对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

赵孟雷

目的 研究番茄红素(Lycopene，LP)对人肝癌HepG2细胞生长的影响并初探其机制。方法 取对数生长期HepG2细胞设空白对照组、LP(5 μg/mL)组、LP(10 μg/mL)组、LP(20 μg/mL)组和顺铂(40 μg/mL)组，每组设10个复孔；各组分别给药干预48 h后，噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖抑制率，流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡状况，RT-PCR法检测Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表达，Western blot法检测Caspase-3蛋白表达。结果 与空白对照组比较，经LP(10 μg/mL、20 μg/mL)或顺铂40 μg/mL干预48 h能够显著提高HepG2细胞增殖抑制率，延长细胞周期中G0/G1期而缩短G2/M期，提高细胞凋亡率，上调促凋亡Bax mRNA表达并下调抑凋亡Bcl-2 mRNA表达，提高Bax/Bcl-2比值，上调Caspase-3蛋白表达，LP上述作用具有一定的剂量依赖性。结论 LP具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖并促进其凋亡的作用，其机制可能与LP干预细胞周期分布和调节凋亡相关基因蛋白表达有关。

番茄红素；肝细胞癌；HepG2细胞；增殖；凋亡

1 材料与方法1.1 细胞、药物与试剂

人肝癌HepG2细胞株由河北医科大学细胞生物研究室惠赠；LP购自南京泽朗生物科技有限公司(批号：20150724，纯度≥96%)；顺铂购自江苏豪森药业股份有限公司(规格：6 mL：30 mg)；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司；Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；MTT购自Sigma公司；Caspase-3单抗购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要仪器

超净工作台(江苏苏净集团有限公司)；细胞培养箱(美国Thermo Electron公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)；电泳仪和转印泳槽(北京六一仪器厂)；RT-PCR(新未来仪器技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、分组与给药 人肝癌HepG2细胞株经复苏后植入DMEM高糖培养基进行培养并取对数生长期细胞进行下一步实验：0.25%胰酶消化、调整细胞浓度为5×104/mL后随机分组，因研究发现LP对肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50)为10 μg/mL，因此设LP(5、10、20 μg/mL)组和顺铂(40 μg/mL)组以及空白对照组，每组设10个复孔(n=10)；各组细胞继续培养24 h后分别给予相应浓度药物进行干预，48 h后行各指标检测。

1.3.2 细胞增殖抑制率、细胞周期、细胞凋亡的测定 药物干预48 h后调整细胞为5×104/mL，转移至96孔板，每孔滴加浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置于细胞培养箱中培养4 h后去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)200 μL，于自动震荡仪振荡10 min后通过酶标仪测定570 nm处吸光度(OD)值，细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。各组细胞经药物干预48 h后PBS洗涤3次、滴加70%乙醇5 mL混匀并置4℃环境48 h后离心取细胞，PBS洗涤、滴加浓度为10 mg/mL的水解酶RNAse 5 μL，置于37℃环境1 h，加入碘化丙啶染液后避光孵育30 min，然后通过流式细胞仪进行检测，采用CELL Quest软件分析各组细胞的细胞周期时相及凋亡情况。

1.3.4 各组HepG2细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达的检测及Bax/Bcl-2比值的计算 通过基因文库查询并设计合成Bcl-2、Bax、β-actin基因上、下游引物；各组细胞经0.25%胰酶消化后离心并收集细胞，依次进行提取总RNA、测定总RNA浓度、反转录为cDNA、行PCR反应处理后，取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察并照相保存。以β-actin为内参，以灰度值进行半定量分析Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相对表达量并计算Bax/Bcl-2比值。

虽然现场试验桩身轴力测试所采用的方法与传统的钢筋计法、应变计法及光纤测试法不同，但该试验方法得到了与传统方法相近的试验结果，即沉桩过程静压PHC管桩贯入阻力与桩端土层软硬程度有关，桩端阻力在硬质土层界面大幅增长，桩侧摩阻力增幅远小于桩端阻力，桩身轴力在未进入硬土层时变化不大.静载试验过程桩侧摩阻力先于桩端阻力发挥作用，且发挥程度远大于桩端阻力，上部土层摩阻力先于下部土层发挥，随着荷载增加桩端阻力所占比例逐渐提高.

1.3.5 各组HepG2细胞Caspase-3蛋白表达的检测 各组细胞经PBS溶液洗涤后行超声裂解，低温离心(4℃，12 000 rpm，20 min)取沉淀，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性(沸水浴加热5 min)、上样(每孔上样30 μg)，经SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜、室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(Caspase-3，β-actin)4℃过夜，洗膜、二抗(1∶100)室温孵育1 h后经ECL系统显影；以β-actin为内参，以条带灰度值测定Caspase-3相对表达量。

1.4 统计学方法

运用软件SPSS 15.0进行数理统计分析，计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人肝癌HepG2细胞增殖抑制率

经LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或顺铂40 μg/mL干预48 h能够显著提高人肝癌HepG2细胞增殖抑制率，且LP对HepG2细胞的增殖抑制作用具有一定的剂量依赖性；而与顺铂组比较，LP(20 μg/mL)组HepG2细胞增殖抑制率显著升高(表1)。

2.2 各组人肝癌HepG2细胞周期

经LP(10 μg/mL、20 μg/mL)干预48 h能够显著延长人肝癌HepG2细胞周期G0/G1期、缩短G2/M期，其中LP(20 μg/mL)组与空白对照组和顺铂组差异均具有统计学差异，提示LP能够阻滞细胞周期而起到抑制细胞增殖的作用(表2)。

2.3 各组人肝癌HepG2细胞凋亡状况

经LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或顺铂干预48 h能够诱导人肝癌HepG2细胞凋亡数量明显增多，LP诱导细胞凋亡的作用具有一定的剂量依赖性(图1)。经LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或顺铂(40 μg/mL)干预48 h能够有效提高人肝癌HepG2细胞AI，且LP 20 μg/mL组人肝癌HepG2细胞AI显著高于顺铂组(表3)。

表1 各组人肝癌HepG2细胞增殖抑制率

Note：**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

表2 各组人肝癌HepG2细胞周期

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

图1 各组人肝癌HepG2细胞凋亡状况Figure 1 The apoptosis of human HepG2 cells in each groupNote：A.blank control group；B.LP 5 μg/mL group；C.LP 10 μg/mL group；D.LP 20 μg/mL group；E.Cisplatin 40 μg/mL group.

GroupNumberAI(%)Blankcontrol103.6±1.7LP5μg/mL1019.5±4.8*LP10μg/mL1042.8±8.5*LP20μg/mL1067.6±10.1*△Cisplatin40μg/mL1036.9±6.8*F15.167P<0.001

Note：*P<0.01，compared to blank control group； △P<0.05，compared to Cisplatin group.

2.4 各组人肝癌HepG2细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达和Bax/Bcl-2比值

经LP(10 μg/mL、20 μg/mL)或顺铂(40 μg/mL)干预48 h能够显著下调人肝癌HepG2细胞Bcl-2 mRNA表达，上调Bax mRNA表达，显著提高Bax/Bcl-2比值；其中LP 20 μg/mL组Bcl-2 mRNA表达较顺铂组显著降低、Bax/Bcl-2比值显著升高(表4)。

2.5 各组人肝癌HepG2细胞Caspase-3蛋白表达

经LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或顺铂(40 μg/mL)干预48 h能够显著上调HepG2细胞Caspase-3蛋白表达量；与顺铂组比较，LP 20 μg/mL组Caspase-3蛋白表达量显著上调(图2，表5)。

GroupNumberBcl-2(×10-3)Bax(×10-3)Bax/Bcl-2Blankcontrol1051.8±13.527.9±24.10.54±0.21LP5μg/mL1035.3±10.932.9±32.80.93±0.30LP10μg/mL1028.9±8.0**74.3±34.5*2.57±0.75**LP20μg/mL1017.8±5.1**△89.9±38.6**5.05±1.09**△Cisplatin40μg/mL1031.5±7.1**100.6±34.7**3.19±1.13*F6.10810.6175.664P0.012<0.0010.015

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

Table 5 The expression of Caspase-3

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

图2 将总Caspase-3调整到一致的程度上检测Caspase-3剪切体表达水平Western blot检测结果Figure 2 The total Caspase-3 level was adjusted to the same amount to detect the cleaved level of Caspase-3 by Western blotNote：A.blank control group；B.LP 5 μg/mL group；C.LP 10 μg/mL group；D.LP 20 μg/mL group；E.Cisplatin 40 μg/mL group.

3 讨论

肝癌是发病率致死率均较高的恶性肿瘤之一[9]；我国每年约11万人死于肝癌，居恶性肿瘤致死率第二位。肝癌具有发病隐匿、发展迅速、转移及侵袭能力强、恶性度高的特点[10-11]，肝癌按最基本的分类原则可分为肝细胞肝癌、胆管细胞肝癌以及肝母细胞瘤等。目前，手术切除后辅以放化疗仍是临床上治疗肝癌的首选方案[12]，但目前临床上手术切除率仅为20%[13]，且5年复发率高达60%以上[14]，严重危害着人类的生命健康。随着病理生理学研究的深入，发现以抑制增殖和促进凋亡为切入点，或许是研究新型抗肿瘤药物的新思路。

既往研究发现，LP能够通过抑制肿瘤细胞侵袭和迁移而对人肺癌H520细胞的扩散具有一定的抑制作用[5]；LP能够通过增强机体免疫力、诱导细胞凋亡而对胃癌具有一定的抑制作用[6]；LP能够通过改变膜电位并促进氧化应激反应而对人宫颈癌HeLa细胞增殖具有抑制作用[15]；此外，张鑫等[7]研究发现LP对前列腺癌LnCaP细胞和人喉癌Hep-2细胞均具有一定的抑制作用[7，16]。本研究采用MTT法检测人肝癌HepG2细胞增殖抑制率发现：经LP干预48 h能够显著提高人肝癌HepG2细胞增殖抑制率，且LP 20 μg/mL剂量组细胞增殖抑制率显著高于顺铂组；经FCM检测发现：经LP干预48 h能够阻滞细胞周期于G0/G1期、提高细胞凋亡率；且与顺铂组比较，LP 20 μg/mL组细胞凋亡率显著升高，提示LP具有抑制HepG2细胞增殖并促进其凋亡的药理学作用。

细胞凋亡过程有多种基因蛋白参与调控，其中Caspase-3是激活各种凋亡刺激因子(Apaf-1)的关键蛋白酶，参与细胞凋亡的启动及整个凋亡过程的调节；Bcl-2能够抑制线粒体破裂，可直接与Apaf-1结合而抑制Caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax细胞毒性作用，调节细胞内钙浓度，从而起到抑制细胞凋亡的作用[17-18]；Bax属于Bcl-2基因家族成员，具有诱导线粒体渗透性改变而释放细胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而表现出促细胞凋亡作用[19]。Bax与Bcl-2能够形成二聚体，所以Bax/Bcl-2比值更加能够体现Bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用[20-22]。本研究发现，经LP干预能够调节HepG2细胞Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表达，提高Bax/Bcl-2比值，上调Caspase-3蛋白表达，这可能是LP诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的重要分子机制之一。

综上所述，LP可能通过抑制增殖并促进凋亡而对人肝癌HepG2细胞生长起到一定的抑制作用，其机制可能与LP改变细胞周期以及调节凋亡相关基因蛋白表达有关。

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(收稿：2016-09-07)

Effects of lycopene on the proliferation and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

ZHAOMenglei

Handan Central Hospital，Handan 056001，China

Objective The objective of this study was to investigate effects of lycopene(LP)on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and to explore its mechanism.Methods HepG2 cells in logarithmic growth phase were treated with 0，5，10，20 μg/mL of LP and 40 μg/mL of Cisplatin for 48 h.Ten replicates in each dose were designed in this study.After treatments，the cell viability was measured by MTT colorimetric assay.The distribution of cell cycle was detected by flow cytometry(FCM).The mRNA expression of Bax and Bcl-2 were measured by RT-PCR.The expression of Caspase-3 protein was explored by Western blot.Results The inhibition rate of HepG2 cells was significantly increased by 10 μg/mL and 20μg/mL of LP or 40 μg/mL of cisplatin when compared to the negative control group.The cell cycle of HepG2 cells were arrested at the G0/G1phase and the apoptosis rate were significantly increased in comparison with the negative control group.The level of Bax mRNA expression was significantly increased and decreased in the expression of Bcl-2 mRNA.They were shown an increasing ratio of Bax/Bcl-2 and up-regulated Caspase-3 protein in HepG2 cells treated with LP.All effects in this study show a dose-dependent manner.Conclusion LP can inhibit the proliferation and promote the apoptosis in HepG2 cells.This mechanism may be contributed to arresting cell cycle and regulating gene expression related to apoptosis.

Lycopene；Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells；Proliferation；Apoptosis

邯郸市中心医院普外三科(邯郸 056001)

赵孟雷，男，(1981-)，硕士，主治医师，从事外科疾病的研究。

赵孟雷，E-mail：hdzhml@163.com

【文献标识码】 A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.004