长链非编码RNA EPB41L4A-AS2对乳腺癌的预后研究

陈芊霖 庞 达

长链非编码RNA EPB41L4A-AS2对乳腺癌的预后研究

陈芊霖 庞 达

目的 通过检测乳腺癌组织中EPB41L4A-AS2的表达，评价其临床病理特征与乳腺癌患者预后之间的关系。方法 利用癌症基因组Meta分析、TCGA和GEO数据集，评价EPB41L4A-AS2的表达量与乳腺癌的临床组织特征之间的关系。利用Western blot实验，在乳腺癌细胞水平验证EPB41L4A-AS2与凋亡通路的关联性。结果 在Meta分析、TCGA和基因表达库(GEO)数据集的结果中发现，乳腺癌组织中EPB41L4A-AS2低表达，并且与不良的临床病理特征呈正相关。而在乳腺癌细胞系中的实验验证了EPB41L4A-AS2与细胞经典凋亡通路相关联。在GEO中进行Meta分析的预后研究中，发现EPB41L4A-AS2的高表达与良好的疾病预后有关。结论 EPB41L4A-AS2抑制了肿瘤的形成，对乳腺癌的临床预后分析有较高价值。

长链非编码RNA；乳腺癌；EPB41L4A-AS2

乳腺癌是世界女性最常见的恶性肿瘤。随着中国社会经济发展，生活方式的改变，乳腺癌危险因素也普遍存在，预计未来我国乳腺癌的发病率和死亡率还将持续上升。而乳腺癌除了威胁患者的生命外，还严重损害患者的生活质量，对女性患者的心理伤害和负担都极其沉重。而男性患者更是讳疾忌医，发现时往往进入晚期。所以简单早期的癌症筛查，和保乳术后持续的预后关注，在目前乳腺癌治疗中是重中之重，而LncRNA有望成为这样一种预测指标。

LncRNA是一种长度>200 nt且不表现蛋白质编码潜能的非编码RNAs，结构上与mRNAs相似，但序列中不存在开放阅读框。与蛋白质相比LncRNAs空间结构稳定性较差，因此可快速分解和产生，为有机体提供更加敏感的调节。LncRNAs序列保守性较差，承受的进化压力较小，但含有一些高度保守的局部区域，这些高保守元件于特定LncRNAs功能发挥具有重要作用。LncRNA与肿瘤的发生有密切的关系，所以在肿瘤细胞中表达异常的LncRNA有希望作为肿瘤标志物用于肿瘤的诊断。LncRNA的早期诊断价值更大，因为这时肿瘤组织较小，在影像学上难以分辨。而我们研究的EPB41L4A-AS2就是这样一种LncRNA。通过数据库分析我们将验证其与乳腺癌患者预后之间的联系，并进一步分析其作为预后评估指标的可能性。而证明其与凋亡经典通路相关，将会使我们更接近其作用通路的上下游，从而在分子角度分析其发挥作用的原理。

1 材料与方法

1.1 患者标本和临床评估

具有乳腺癌组织学诊断且在手术前未接受化疗和放疗的患者符合本研究的条件。因此，从哈尔滨医科大学附属肿瘤医院获取250例乳腺癌组织与50例正常组织。所有的样本均在手术切除后立即冷冻在液氮中，仅有肿瘤细胞>80%的肿瘤被切除以提取RNA。由两位独立的资深病理学家，对每个肿瘤组织的病理学诊断及分子亚型的鉴定进行证实。经哈尔滨医科大学附属肿瘤医院的研究伦理委员会批准，课题组已获得所有患者的书面知情同意书。

1.2 EPB41L4A-AS2 RNA提取与实时定量PCR

从液氮冷冻保存的新鲜样本中提取总RNA。应用高容量的cDNA逆转录试剂盒，将总RNA(2 μg)逆转录成cDNA。应用实时PCR系统，通过qRT-PCR确定EPB41L4A-AS2相对管家基因GAPDH的相对水平。对EPB41L4A-AS2，所应用引物特定序列为5′-CGGAGCAGGTGCAATCTGT-3′(正)和5′-TCAAAACTACGTCTGATGCCAAA-3′(反)；GAPDH，所应用引物的特定序列为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(正)和5′-TCCACCCTGTTGCTGTA-3′(反)。PCR扩增三次，第一次温度95℃时间10 min，然后40个周期，温度95℃ 10 s，接着60℃ 60 s。应用GAPDH的表达作为一种内部对照，在每个样本中定量EPB41L4A-AS2 cDNA。通过比较CT法(2-ΔCT)来确定EPB41L4A-AS2转录和GAPDH的相对水平。

1.3 公共数据分析

TCGA的乳腺癌lncRNA全基因组表达谱显示EPB41L4A-AS2均出现下调。通过总结矫正了所有映射到这个基因的探针强度的背景，来计算LncRNA EPB41L4A-AS2的表达。从GEO数据库中下载原CEL文件并调整背景[1]。研究特异性中位数表达作为中止来区分EPB41L4A-AS2的表达，从而定义中位数或中位数以上的“较高值”与中位数以下的“较低值”。应用审查管理器进行荟萃分析，分析基因共表达及基因本体术语的富集[2-3]。

1.3.1 GEO数据的下载与使用 通过GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)公共数据库，下载乳腺癌相关的数据集，整理表达信息与预后信息的关系，通过Kaplan-Meier方法绘制EGOT的高低表达与预后的关系。

1.3.2 TCGA数据的下载与使用 通过TCGA公共数据库(http：//cancergenome.nih.gov/)，下载乳腺癌、肺癌、肾癌的EPB41L4A-AS2表达与预后相关的数据，分析EPB41L4A-AS2在癌组织及癌旁组织的表达差异，采用Kaplan-Meier方法绘制EPB41L4A-AS2高低表达与预后的关系。

1.3.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件(SPSS Inc Chicago，USA)进行统计分析。所有数据计量资料以均数±标准差表示，各组间的差异应用Student′st检验；对各临床病理参数及比较进行χ2检验；单因素生存分析用Kaplan-Meier方法；多因素生存分析用Cox风险模式。P<0.05认为差异具有统计学意义。

1.4 Western blot实验

Western blot检测EPB41L4A-AS2过表达组与对照组中Bcl2及Bax表达变化情况。使用MCF-7乳腺癌细胞系慢病毒转染EPB41L4A-AS2，形成过表达细胞系AS2组，及空转对照组Flag组。(1)提取蛋白并用BCA试剂盒检测提取蛋白浓度；(2)SDS-PAGE：制备SDS-PAGE胶，分别取对照组总蛋白及过表达组总蛋白60 μg做Flag-1组及AS2-1组，再分别取50 μg总蛋白做Flag-2组及AS2-2组，上样跑电泳(100 V，1.5 h)；(3)转膜：用PVDF膜进行转膜(200 mA，1 h)；封闭：用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h；孵育抗体及显色：4℃一抗孵育过夜(anti-Bcl2 1∶100、anti-Bax 1∶1 000、anti-Tubulin 1∶1 000)，回收一抗，用TBST洗膜2～3次，每次15 min；用HRP标记的二抗于37℃孵育2 h，回收二抗，用TBST洗膜2～3次，每次15 min；进行ECL显色，扫描，Bandscan分析胶片灰度值。

2 结果

2.1 组织中EPB41L4A-AS2的低表达与乳腺癌病理的关系

为了评价乳腺癌中EPB41L4A-AS2的表达，利用实时定量PCR(qRT-PCR)对250个乳腺癌组织与50个癌旁正常组织进行了检验。根据中间值，将乳腺癌组织中EPB41L4A-AS2的表达分为高水平或低水平。与正常组织相比，乳腺癌组织中EPB41L4A-AS2的水平下调(P=0.005；图1A)。在五种乳腺癌分子亚型中，相比另外四种亚型，Luminal A亚型中的EPB41L4A-AS2高表达(P<0.001；图1B)。

图1 利用qRT-PCR检测的人类乳腺癌组织及相邻非癌组织中EPB41L4A-AS2表达Figure 1 The expression of EPB41L4A-AS2 in breast cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues detected by qRT-PCRNote：A.Relative expression of EPB41L4A-AS2 in 250 breast cancer tissues and 50 adjacent non-cancerous tissues；B.Relative expression of EPB41L4A-AS2 among 5 molecular subtypes of breast cancer.The levels of EPB41L4A-AS2 were performed in triplicates by qRT-PCR and were normalized using GAPDH.LA：Luminal A subtype；LB：Luminal B subtype；TNB：Triple negative subtype.** P<0.05，compared to the adjacent tissues.

2.2 在三种恶性肿瘤中EPB41L4A-AS2的表达特征

应用TCGA数据来确定患不同实体肿瘤的患者中，EPB41L4A-AS2的表达是否相似。相比正常组织而言，乳腺癌组织中EPB41L4A-AS2水平下调(P<0.001；图2A)。相比那些激素受体阴性的患者而言，激素受体阳性的患者有较高的EPB41L4A-AS2水平(P<0.001；图2B-2C)。此外，相比激素受体阳性的患者而言，HER-2阴性患者有较高的EPB41L4A-AS2表达(P=0.036；图2D)。

除了乳腺癌之外，还分析了肾脏肿瘤和肺癌。与正常组织相比，在肾脏肿瘤组织中观察到了EPB41L4A-AS2的低表达(P<0.001；图2E)。还在肺癌组织和正常组织的比较中得出了相同的结论(P<0.001；图2F)。从而表明，EPB41L4A-AS2可能是一种肿瘤抑制物。

2.3 EPB41L4A-AS2与细胞经典凋亡通路相关性

Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl2、Bax结果(取目标灰度值与内参灰度值的比值分为Flag-1、AS2-1、Flag-2、AS2-2四组，再以Flag组和对应AS2组进行非配对T检验，2组对1组进行辅助验证)显示，过表达EPB41L4A-AS2后，乳腺癌细胞中Bax蛋白的表达显著上调，差异有统计学意义(t=5.232)，而Bcl2蛋白的表达显著下调，差异有统计学意义(t=4.597)(图3)，这为进一步研究其在凋亡通路上的作用奠定了基础。

2.4 EPB41L4A-AS2高表达与乳腺癌患者总生存率的关系

应用组Ⅰ和Ⅲ(来自GEO数据库)来研究EPB41L4A-AS2表达和预后之间的关系。在组Ⅰ中，与高表达的患者相比，EPB41L4A-AS2低表达的乳腺癌患者有较差的总体生存率(OS)(P=0.028；图4A)。

在乳腺癌中TP53突变很常见，这通常会导致耐药。故而进一步探究TP53突变和EPB41L4A-AS2表达之间的关系。在EPB41L4A-AS2高表达的TP53乳腺癌对照组中观察到了较好的OS，而在TP53突变的乳腺癌患者中观察到了相反的结果(分别为P<0.01和P=0.43；图4B)。在无复发生存率(RFS)及无远端转移生存率(DMFS)中，相比EPB41L4A-AS2低表达患者而言其高表达的乳腺癌患者有较好的预后(P<0.01，P=0.024；图4C-4D)。

图3 LncRNA EPB41L4A-AS2对凋亡蛋白Bcl2、Bax表达的影响Figure 3 The influence of LncRNA EPB41L4A-AS2 on the expression of apoptosis proteinNote：A.The expression of Tubulin，Bcl-2 and bax protein was detected by Western blot；B.The expression of Bax was normalized by Tubulin.Statistical analysis is carried out in accordance with the group(t=5.232)；C.The expression of Bcl2 was normalized by Tubulin.Statistical analysis is carried out in accordance with the group(t=4.597).

图2 TCGA不同实体肿瘤中的EPB41L4A-AS2表达Figure 2 EPB41L4A-AS2 expression in different solid tumors in TCGANote：A.TCGA data show the results in breast cancer tissues(N=837)and normal tissues(N=105)；B.CGA data show the results in breast cancer with ER positive(N=584)or negative(N=174)；C.CGA data show the results in breast cancer with PR positive(N=508)or negative(N=247)；D.CGA data show the results in breast cancer with HER-2 positive(N=113)or negative(N=630)；E.CGA data show the results in renal cancer tissues(N=448)and normal tissues(N=47)；F.TCGA data show the results in lung cancer tissues(N=478)and normal tissues(N=58).***P<0.001，*P<0.05，compared to the tumor tissues or ER negative or PR negative or HER-2 negative.

3 讨论

本研究首先基于乳腺癌组织的分级、大小、疾病阶段、受体状态以及分子亚型的不同，对比EPB41L4A-AS2的表达，发现在预后较好的亚型中其表达量较高。进而进行TCGA数据分析，发现乳腺癌组织中EPB41L4A-AS2水平下调，相比激素受体阴性的患者，激素受体阳性的患者EPB41L4A-AS2高表达；相比激素受体阳性的患者而言，HER-2阴性的患者EPB41L4A-AS2高表达。不止如此，本研究还分析了肾脏肿瘤和肺癌，与对应的正常组织相比，在肾脏肿瘤和肺癌组织中均观察到了EPB41L4A-AS2的低表达。从而表明，EPB41L4A-AS2可能是一种肿瘤抑制物。而且相对正常组织而言，该LncRNA—MALAT1在实体肿瘤组织上调[4-6]。肿瘤组织中EPB41L4A-AS2的异常表达，提示它可能是一种肿瘤抑制基因。

Western blot实验发现过表达EPB41L4A-AS2能够增加凋亡相关蛋白Bax表达，却减少抑凋亡基因Bcl-2的表达，这说明其在经典凋亡通路上有所作用。

基于已发现EPB41L4A-AS2的下调与较差的生存结局相关，那么认为其作为肿瘤标志物可以在乳腺癌临床预后中存在潜在作用。这不禁让人联想到LncRNA HOTAIR，其不仅在乳腺癌中，还在其它实体肿瘤内，比如胃癌与肺癌，都被确定为一种预后标志物[7-12]。为了确定EPB41L4A-AS2是否存在相似的预测潜力，本研究应用GEO数据库对EPB41L4A-AS2表达和预后之间的关系进行了研究。发现当与高表达的患者相比，EPB41L4A-AS2低表达的乳腺癌患者有较差的总体生存率。在乳腺癌中TP53突变很常见，这通常会导致耐药。故本研究进一步探究TP53突变和EPB41L4A-AS2表达之间的关系。结果在EPB41L4A-AS2高表达的TP53乳腺癌对照组中观察到了较好的生存率，而在TP53突变的乳腺癌患者中观察到了相反的情况。在无复发生存率及无远端转移生存率中，相比EPB41L4A-AS2低表达患者而言其高表达的乳腺癌患者有较好的预后。由此，有多组数据可认为EPB41L4A-AS2表达和乳腺癌预后之间存在明显关联。

综上所述，本研究认为EPB41L4A-AS2抑制了乳腺肿瘤的形成，并且与乳腺癌患者的良好预后相关。

1 Risueno A，Fontanillo C，Dinger ME，et al.GATExplorer：genomic and transcriptomic explorer；mapping expression probes to gene loci，transcripts，exons and ncRNAs[J].BMC Bioinformatics，2010，11(221)：1-12.

2 Huang da W，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nat Protoc，2009，4(4)：44-57.

3 Zhang B，Horvath S.A general framework for weighted gene co-expression network analysis[J].Stat Appl Genet Mol Biol，2005，4(1)：1-43.

4 Wei Y，Niu B.Role of MALAT1 as a Prognostic factor for survival in various cancers：A systematic review of the literature with meta-analysis[J].Disease Markers，2015，1(6)：1-9.

5 Yang L，Bai HS，Deng Y，et al.High MALAT1 expression predicts a poor prognosis of cervical cancer and promotes cancer cell growth and invasion[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19(17)：3187-3193.

6 Zhang J，Zhang B，Wang T，et al.LncRNA MALAT1 overexpression is an unfavorable prognostic factor in human cancer：evidence from a meta-analysis[J].Int J Clin Exp Med，2015，8(4)：5499-5505.

7 Loewen G，Jayawickramarajah J，Zhuo Y，et al.Functions of LncRNA HOTAIR in lung cancer[J].J Hematol Oncol，2014，7(90)：1-10.

8 Gokmen-Polar Y，Vladislav IT，Neelamraju Y，et al.Prognostic impact of HOTAIR expression is restricted to ER-negative breast cancers[J].Sci Rep，2015，5(8765)：1-5.

9 Gu Y，Chen T，Li G，et al.LncRNAs：emerging biomarkers in gastric cancer[J].Future Oncol，2015，11(7)：1-15.

10 Wang S，Wang Z.Prognostic value of long noncoding RNA HOTAIR in digestive system malignancies[J].J Gastroenterol Hepatol，2015，7(30)：1123-1133.

11 Yu X，Li Z.Long non-coding RNA HOTAIR：A novel oncogene(Review)[J].Mol Med Rep，2015，4(12)：5611-5618.

12 Zhao W，Dong S，Duan B，et al.HOTAIR is a predictive and prognostic biomarker for patients with advanced gastric adenocarcinoma receiving fluorouracil and platinum combination chemotherapy[J].Am J Transl Res，2015，7(7)：1295-1302.

(收稿：2017-01-06)

Long noncoding RNA EPB41L4A-AS2 associated with the prognosis of tumors

CHENQianlin，PANGDa

Harbin Medical University，Harbin 150081，China

Objective The relationship between the clinicopathological features and the prognosis of breast cancer patients was evaluated by the expression of EPB41L4A-AS2 in breast cancer tissues.Methods The relationship between the expression of EPB41L4A-AS2 and the clinical features of breast cancer was evaluated by using the genome meta analysis，TCGA and Gene Expression Library(GEO)datasets.The correlation between EPB41L4A-AS2 and apoptotic pathway was verified by Western blotting.Results The results from Meta-analysis，TCGA and GEO datasets showed that EPB41L4A-AS2 was low in breast cancer tissues and was positively correlated with poor clinical and pathological features.EPB41L4A-AS2 was confirmed an association with the classical apoptosis pathway in breast cancer cell lines.In the meta-analysis of GEO，we found the high expression of EPB41L4A-AS2 with good prognosis.Conclusion EPB41L4A-AS2 inhibits tumor formation and has a high value in clinical prognosis of breast cancer.

Long non-coding RNA；Breast cancer；EPB41L4A-AS2

哈尔滨医科大学(哈尔滨 150081)

陈芊霖，女，(1991-)，硕士研究生，从事乳腺肿瘤学方向的研究。

庞达，E-mail：pangdasir@163.com

R737.3

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.003