钙网蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义*

戴 宇，刘 凯，姚秀华

（南方医科大学附属深圳市妇幼保健院妇科，广东 深圳 518000）

卵巢肿瘤是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤之首，因其发病比较隐匿，许多卵巢癌被确诊时已是晚期。而在卵巢恶性肿瘤中，上皮性卵巢癌约占90%，肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的化疗是上皮性卵巢癌的主要治疗原则。但随之而来的肿瘤细胞耐药问题使相当一部分患者在手术合化疗后仍会出现疾病进展或复发，致使其5年生存率还不到30%。因此，寻找恶性肿瘤的早期诊断指标以及寻找基因的靶向治疗方法逐渐成为一个研究的热点，钙网蛋白 (calreticulin，CRT)为主要存在于内质网 (endoplasmic reticulum，ER)且高度保守的一种Ca2+结合蛋白，包括协助蛋白质加工折叠、调节细胞内钙平衡、抑制肿瘤血管新生和参与抗原递呈及细胞凋亡等功能。最近发现，CRT在临床肿瘤的诊断及治疗方面有着不可估计的应用前景，成为研究热点之一。但有关CRT在卵巢癌中的研究尚无报道。本研究采用免疫组织化学方法，检测CRT在不同生理、病理状态下的卵巢组织中蛋白的表达，从而寻找可预测肿瘤恶性潜能的生物学标志物，为采取有效的预防措施，选择新的治疗靶点，制定合理有效的综合治疗方案奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取深圳市妇幼保健院2013-01—2015-12间手术切除的组织标本，包括40例上皮性卵巢癌，20例卵巢良性肿瘤，10例正常卵巢组织，上皮性卵巢癌患者40例，其中浆液性癌28例，粘液性癌12例；高-中分化癌14例，低分化癌26例；按国际妇产科联盟（FIGO）临床分期标准，I～II期11例，III～IV期29例；有淋巴转移25例，未转移15例，所有的病例术前均未接受放疗、化疗或激素治疗。良性卵巢肿瘤20例，10例正常卵巢组织 (来自卵巢活检、子宫肌瘤或功能性子宫出血、子宫脱垂的病例行全子宫切除同时行卵巢切除，病理证实卵巢组织无异常者)，病理诊断经两位病理专家确证。组织标本10%甲醛固定，石蜡包埋，制备成4μm厚切片。

1.2 方法

免疫组织化学检查采用S-P两步法。鼠抗人CRT多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物科技公司，工作浓度1∶200。免疫组化S-P试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司，整个过程按试剂盒说明书进行。每批染色均设已知阳性切片（肝癌）作阳性对照，用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

每张切片于400倍光镜下随即选取4个视野，采用Metamorph/DP10/BX41显微图像分析系统，对其中一个具有代表意义的阳性结果视野的棕黄色颗粒进行标记，以此标准自动检测所有视野的阳性结果，以参数积分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白颗粒密度。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量单位以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析和独立样本Dunnett t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在上皮性卵巢癌中表达水平明显高于在卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达（见表1）。进一步分析CRT的表达与卵巢癌某些临床病理参数之间的关系，经统计学检验，CRT与组织病理分级（P＜0.05）、临床分期（P＜0.05）和淋巴结转移（P＜0.05）有关，与组织学分型（P＞0.05）无关（见表2）。

图1 CRT在上皮性卵巢癌中的表达（S-P 400×）

图2 CRT在正常卵巢组织中的表达（S-P 400×）

表1 CRT在正常卵巢组织及上皮性卵巢肿瘤中的表达（±s）

表1 CRT在正常卵巢组织及上皮性卵巢肿瘤中的表达（±s）

注:1)vs 2)，P＜0.05；1)vs 3)，P＜0.05；2)vs 3)，P＜0.05。

分组正常卵巢组织1)良性卵巢肿瘤2)上皮性卵巢癌3)例数OPN F/P 10 20 40(IOD值)3.21±4.50 16.54±7.04 90.26±10.29 F=9.55 P＜0.05

3 讨论

CRT最先由Ostwald和Maclennan于1974年从骨骼肌肌浆网中首次分离获得，是一种普遍存在且高度保守的内质钙结合蛋白。CRT是热休克蛋白家族的一员，分子大小约46kD，由单一基因编码，人类CRT基因位于第19号染色体(p13.2～p13.3)，由9个外显子和8个内含子构成，长度为1254 bp，编码由417个氨基酸组成的酸性蛋白质，最初被认为是一种内质网钙结合蛋白，主要位于内质网腔，普遍存在于除酵母和原核生物以外的哺乳动物细胞及植物中。后有研究发现，CRT还存在于胞膜、胞质或胞外基质等，即所谓的非ER-CRT[1]。CRT由3个结构域组成，包括球状N-末端结构域、富脯氨酸P结构域和酸性C末端结构域[2]，每个结构均发挥独特的病理生理学作用。钙网蛋白最初的功能是调节细胞内外Ca2+浓度的稳定及作为分子伴侣、协助蛋白质正确折叠[3]。随着研究的不断深入，发现CRT是多功能蛋白质，在抗原的提呈、血管的发生、细胞黏附、细胞凋亡及自身免疫系统疾病中发挥着重要作用，CRT表达量的改变可以使细胞的侵袭、黏附、增殖等生物学行为发生改变，与肿瘤的发生发展、预后密切相关[4]。

表2 CRT的表达与临床病理特征的关系（±s）

表2 CRT的表达与临床病理特征的关系（±s）

临床病理指标组织病理分级高-中分化低分化临床分期I～II期III～IV 期组织学分型浆液性囊腺癌黏液性囊腺癌淋巴转移例数OPN表达（IOD值）t P 14 26 44.30±12.54 90.44±13.42 4.51P＜0.05 11 29 56.32±11.74 110.21±15.06 2.48P＜0.05 28 12 89.41±21.41 93.17±18.56 0.21P＞0.05无有15 25 61.67±20.24 112.34±18.42 3.04P＜0.05

恶性肿瘤死亡率高的一个重要的原因是不能早期诊断，许多患者在明确诊断后往往已经是晚期，错过了最佳的治疗时机。而缺乏特异性高、敏感性强的肿瘤标记物是导致不能早期诊断的直接原因。因此，寻找出新的有利于早期诊断的肿瘤标记物意义重大。近年许多研究发现，多种肿瘤中CRT及其裂解片段有量的改变。Liu等[5]研究发现，肺癌细胞膜上的CRT表达水平与肿瘤的病理分型和分期相关，小细胞肺癌的CRT水平低于腺癌，然而鳞状细胞癌表达均比前两者高。Sheng等[6]研究结果显示，胰腺癌中CRT mRNA表达水平高于癌旁组织，CRT过表达者的预后好于低表达者。Kageyama等[7]发现，膀胱癌患者尿液中CRT表达较正常患者高，且灵敏度及特异性分别达67%、80%。Kabbage等[8]研究发现，CRT在乳腺癌组织和细胞系中高表达，尤其在高侵袭性的乳腺癌细胞系中表达量高于低侵袭性细胞。CRT在肝癌、食管癌、结肠癌[9]等肿瘤中也呈高表达，近年CRT逐渐成为妇科肿瘤领域中的研究热点。刘倩等[10]研究发现，子宫内膜样腺癌中CRT mRNA水平和蛋白表达水平较正常子宫内膜均升高，韩冰等[11]实验证实，CRT在绒癌耐药细胞系中高表达，下调CRT后耐药指数明显降低，推测CRT可能参与绒癌耐药。以上研究表明，CRT有望成为多种肿瘤的新标记物,有利于协助恶性肿瘤的早期诊断。

本研究结果显示CRT主要定位在细胞的胞浆，其表达与上皮性卵巢癌的组织病理分级、临床分期、淋巴结转移均有关。CRT进一步加快了肿瘤细胞的进程。因此，检测CRT可能成为卵巢癌诊断性标志物及有效的治疗靶点，对改善卵巢癌患者的预后具有重要的意义。最终使降低卵巢癌患者的复发率，提高5年生存率成为可能。

[1]GOLD L I,EGGLETON P,SWEETWYNE M,et al.Calreticulin:nonendoplasmic reticulum functions in physiology anddisease[J].FASEB,2010,24(3):665-683.

[2]MICHALAK M,CORBETT E F,MESAELI N.Calreticulin one protein,one gene,many functions[J].Biochem,1999,344(2):281-292.

[3]GELEBART P,OPAS M,MICHALAK M,et al.Calreticulin,aCa2+-binding chaperone of the endop-lasmic reticulum[J].Cell Biol,2005,37(2):260-266.

[4]ZAMANIAN M,VEERAKUMARASIVAM A,ABDULLAH S,et al.Cal reticulinand cancer[J].Pathol Oncol,2013,19(2):149-154.

[5]LIU R,GONG J,CHEN J,et al.Calreticulin as a potential diagnosticbiomarker for lung cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2012,61(6):855-864.

[6]SHENG W,CHEN C,DONG M,et al.Overexpression of calreticulincontributes to the development and progressionof pancreatic cancer[J].Cell Physiol,2014,229(7):887-897.

[7]KAGEYAMA S,ISONO T,MATSUDA S,et al.Urinary calreticulinin the diagnosis of bladder urothelial carcinoma[J].Int Urol,2009,16(5):48l-486.

[8]KABBAGE M,TRIMECHE M,BERGAOUI S,et al.Calreticulin expression in infiltrating ductal breast carcinomas:relationshipswith disease progression and humoral mmuneresponses[J].Tumor Biol,2013,34(2):1177-1188.

[9]ZAMANIAN M,VEERAKUMARASIVAM A,ABDULLAH S,et al.Calreticulin and cancer[J].Pathol Oncol,2013,19(2):149-154.

[10]刘倩，杨清.钙网蛋白在子宫内膜癌中的表达及临床意义[J].现代妇产科进展，2016,25(4):249-256.

[11]韩冰，向阳，冯凤芝，等.钙网蛋白在甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌中的作用研究[J].实用妇产科杂志，2013,29(3):194-197.