“桂枝与白芍”药对不同比例配伍的HPLC指纹图谱探讨

陈永财+钱江辉+王彬辉+沙先谊

[摘要] 目的 建立“桂枝與白芍”药对不同比例配伍的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，探讨桂枝与白芍不同比例配伍后化学成分差异性及其煎出率变化。 方法 采用HPLC法，以Dikma Spursil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，流动相乙腈-0.1%冰醋酸水洗脱，温度25℃，进样量10 μL，检测波长254 nm，流速1 mL/min。对“桂枝与白芍”药对（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）不同比例配伍的HPLC指纹图谱采用相似度评价软件（2004A版）分析，并用各药对共有色谱峰面积与单煎相对应色谱峰面积的比值比较分析。 结果 确定18个共有峰，指认其中6个色谱峰，对共有峰归属，并进行相似度评价。初步确立单味白芍及桂枝白芍（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）配伍后白芍中共有峰各成分煎出率依次提高，桂枝白芍（5∶3）时煎出效果最佳；桂枝白芍（5∶3）、（1∶2）配伍肉桂酸煎出率降低，可桂枝白芍（1∶1）配伍后肉桂酸煎出率接近单味桂枝，煎出效果最佳。 结论 该方法简单、准确、快速，重复性好，能有效地对“桂枝与白芍”药对的质量控制和成分鉴别及配伍理论提供依据。

[关键词] 桂枝；白芍；药对；高效液相色谱；指纹图谱；成分归属

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（a）-0029-06

Discussion on HPLC fingerprints for the different compatibility proportion Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba

CHEN Yongcai1 QIAN Jianghui2，3 WANG Binhui4 SHA Xianyi2，3

1.Department of Pharmacy， Wenzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Provicne， Wenzhou 325000， China； 2.Staff Room of Pharmacy， School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China； 3.Academy of Integrative Chinese and Western Medicine， Fudan University， Shanghai 201203， China； 4.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Medical College of Taizhou University， Zhejiang Province， Taizhou 318002， China

[Abstract] Objective The high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprints for the different compatibility proportion Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba was developed to explore the component difference and the changing of solution rate. Methods The HPLC method with Dikma Spursil C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column was used， the mobile phase was acetonitrile-0.1% acetic acid solution with gradient elution， the column temperature was 25℃， the inject volume was 10 μL， the detection wavelength was set at 254 nm， the flow rate was 1 mL/min. Similarity evaluation software （2004A edition） was adopted to analyze the HPLC fingerprints of the different compatibility proportion of Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba at the ratio of 1∶1， 1∶2 and 5∶3， and the common peaks area were compared with the single drug solution. Results 18 common peaks were found and 6 chromatographic peaks were identified. Evaluation of similarity was done for these common peaks. The results showed that the extraction rate of common peaks from Radix Paeoniae Alba increased in the order of 1∶1， 1∶2， 5∶3 for the mixture of Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba， and reached its highest level at 5∶3. While the extraction rate of cinnamic acid decreased in the order of 5∶3， 1∶2 and reached the lowest level at a ratio of 1∶1， which was equal with the extraction rate of a single Ramulus Cinnamomi. Conclusion The method is simple， reproducible， and accurate， which can be applied to the quality control and provides some compatibility theoretical bases for the drug pair of Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba.

[Key words] Ramulus Cinnamomi； Radix Paeoniae Alba； Drug pairs； High performance liquid chromatography； Fingerprint； Component attribution

“桂枝与白芍”为典型的相制配伍，源于《伤寒论》之桂枝汤，为临床常用的调和营卫、温通止痛药对[1]。二者伍用桂枝汤（桂枝∶白芍为1∶1，以9～10 g为宜），治太阳中风表虚证；桂枝加芍药汤（桂芍1∶2）治太阳病误下伤中土虚木乘之腹痛；桂枝加桂汤（桂芍5∶3）治心阳虚弱寒气凌心之奔豚[2-3]，可见中医临床合理应用“桂枝与白芍”药对关键在于不同剂量配伍[4]。现代研究证明，桂枝中桂皮醛、肉桂酸等成分，白芍中芍药苷、芍药内酯苷等成分具有明显的药理活性[5-8]，药对功效物质基础不是二味药叠加，而是二味药不同成分相互作用形成的共同体，研究不同配比功效物质的溶出变化特点，可为阐明现有药对配伍比例的变化规律提供依据[9-11]，可见分析桂枝与白芍不同比例配伍后化学成分差异性及其煎出率变化尤为关键。

本研究选取单味桂枝、单味白芍、桂枝与白芍分别按（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）不同比例配伍为研究对象，对各组水煎液提取物采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱研究。通过HPLC指纹图谱对比分析不同配伍比例间的化学成分差异性及其煎出率变化，为“桂枝与白芍”药对质量控制和成分鉴别及配伍提供理论依据[12-14]。

1 仪器与试剂

岛津高效液相色谱仪（LC-15C）、分析色谱柱（Dikma Spursil C18 250 mm×4.6mm，5 μm）、分析天平（BT 25S，北京赛多利斯）、天平（BT 210S，北京赛多利斯）、旋涡振荡仪（XW-80A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、超声波清洗器（SK2510HP，上海超导超声仪器有限公司）。

乙腈（色谱纯AS1122-801 Tedia），其余试剂分析纯。芍药苷、桂皮醛对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110736-201438、110710-201418），儿茶素、没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芍药苷内酯、没食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚对照品（上海同田制药，批号：15082731、15033122、15090235、15051322、15010332、15072821、15012321、15072141、15051935、15072836）。桂枝、白芍中药饮片（浙江华宇中药饮片有限公司，批号：1503190、1505100），经浙江中医药大学熊耀康教授鉴定桂枝为樟科植物肉桂（Cinnamomμm cassia Presl）的干燥嫩枝，白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall）的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

岛津液相色谱仪（LC-15C），Dikma Spμrsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.1%冰醋酸水（B），梯度洗脱程序见表1[15-17]，柱温：25℃，检测波长：254 nm，流速：1 mL/min，进样量：10 μL。

2.2 混合对照品溶液的配制

分别精密称取芍药苷、桂皮醛、儿茶素、没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芍药苷内酯、没食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚12种对照品10 mg，用甲醇配成1 mg/mL母液。取上述各对照品母液200 μL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，配制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的配制

2.3.1 不同比例配伍水煎液提取物制备 按桂枝与白芍药对（1∶1）称桂枝90 g、白芍90 g，按正交优选条件[18]加水量10倍，浸泡60 min，煮沸后微火煎煮60 min，合并2次提取液，过滤，将滤液减压浓缩并调整浓度至（1∶6）浸膏备用，精密称取100 mg浸膏，加50%乙腈水溶液10 mL，旋涡振荡仪涡旋1 min，超声5 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，按“2.1”项下色谱条件测定。

按桂枝与白芍药对（1∶2）称桂枝60 g、白芍120 g；按桂枝与白芍药对（5∶3）称桂枝112.5 g、白芍67.5 g，同上述方法分别制备桂枝白芍药对（1∶2）和桂枝白芍药对（5∶3）供试品。

2.3.2 桂枝和白芍单味水煎液提取物制备 称桂枝90 g和单味白芍90 g分别单独煎煮，按“2.3.1”项下方法制备单味桂枝和单味白芍供试品。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取“2.3.1”项下配制桂枝白芍（1∶1）供试液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次。以芍药苷为参照峰，各主峰相对保留时间RSD值为0.03%～0.56%，相对峰面积为0.31%～1.97%，表明方法精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取“2.3.1”项下配制桂枝白芍（1∶1）供试液，重复制备6次，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以芍药苷为参照峰，各主峰相对保留时间RSD值为0.21%～1.02%，相对峰面积为0.81%～2.17%，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取“2.3.1”项下配制桂枝白芍（1∶1）同一供试品液，分别于0、2、4、8、12 h检测，按“2.1”项下色谱条件进行测定。芍药苷为参照峰，各主峰相对保留时间RSD值为0.15%～0.92%，相对峰面积为0.71%～2.30%，表明供试品溶液在12 h内基本保持稳定。

2.5 桂枝与白芍药对指纹图谱建立

2.5.1 共有特征峰的确立 取“2.3.1”项下分别配制桂枝白芍（1∶1）、桂枝白芍（1∶2）和桂枝白芍（5∶3）供试液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。将不同药对指纹图谱，采用国家药典委员会“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件（2004A版）”分析，时间窗口设为0.1，经多点校正和数据匹配，以平均数法生成指纹图谱和对照指纹图谱（图1）。根据色谱出峰时间、色谱峰分离度及色谱峰型确定了18个共有特征峰。

2.5.2 桂枝白芍不同比例配伍相似度计算 根据表2桂枝白芍不同比例配伍相似度可得，相似度最小为0.935且大于0.9，结果表明建立的指纹图谱能够定性考察不同比例配伍桂枝与白芍水煎液。

2.5.3 桂枝白芍不同比例配伍特征峰相对保留时间 桂枝白芍不同比例配伍18个共有峰中芍药苷出峰时间[（13.6±0.5）min]稳定，与其他相邻峰分离度较好，因此选为参比峰。以芍药苷出峰时间为1，计算18个共有峰的相对保留时间，结果表明桂枝白芍不同比例配伍18个共有峰相对保留时间RSD值均小于2%，说明指纹图谱各成分出峰时间稳定。见表3。

2.5.4 桂枝白芍不同比例配伍色谱峰 各组样品的典型色谱图如图2所示。样品中各成分均能达到基本分离要求，表明建立的色谱分析方法符合中药指纹图谱分析的基本要求。

2.6 HPLC指纹图谱共有峰的来源认定

通过比对单味药的色谱峰，不同比例配伍桂枝与白芍药对HPLC指纹图谱18个共有峰中编号1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、17号共13个峰均来源于单味药白芍，编号2、3、5、7、11、13、14、15、16、18号共10个峰来源于单味药桂枝，其中编号2、3、5、7、11号5个峰为两味中药共同产生（图3）。不同比例配伍桂枝与白芍药对18个共有峰是桂枝、白芍各自色谱峰的加和，二味药合煎并未发现新的色谱峰。

通过混合对准品标准色谱图（图4）对各样品指纹图谱的各峰进行定性认证，结果表明编号3、5、9、10、13、16号峰分别为没食子酸、原儿茶酸、芍药苷内酯、芍药苷、香豆素、肉桂酸，除没食子酸（3号峰）和原儿茶酸（5号峰）为桂枝、白芍共有外，其余各峰均是各单味药所特有的色谱峰。

2.7 桂枝白芍药对HPLC指纹图谱定量分析

所有指纹图谱数据经过处理，将各样品中桂枝生药量换算成一致的量，以桂枝单煎样品峰面积分别作为参比，将其他各样品13、14、15、16、18的峰面积（除桂枝白芍共同峰外）与其峰面积相比，计算相对峰面积，结果见表4。由表4可知，桂枝中各成分配伍后煎出率的变化有以下特点：13#峰（香豆素）、15#峰、16#峰（肉桂酸）煎出率受配伍比例的影响较大，13#峰（香豆素）煎出率有较大提高，15#峰煎出率桂枝白芍（1∶1）配伍后有很大提高，可桂枝白芍（5∶3）、（1∶2）配伍时不受影响，16#峰（肉桂酸）煎出率桂枝白芍（5∶3）、（1∶2）配伍时降低，可桂枝白芍（1∶1）配伍后肉桂酸煎出率接近单味桂枝，煎出效果最佳。

各组HPLC指纹图谱数据中白芍生药量换算成一致的量，以白芍单煎样品峰面积分别作为参比，将其他各样品色谱图中编号1、4、6、8、9、10、12、17的峰面积（除桂枝白芍共同峰外）与其峰面积相比，计算相对峰面积，结果见表5。由表5可知，白芍中共有峰各成分配伍后煎出率有很大提升，其煎出率提高与白芍比例成非线性关系，桂枝白芍（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）配伍后白芍中共有峰各成分煎出率依次提高，桂枝白芍（5∶3）时煎出效果最佳。

3 讨论

本研究优选流动相过程中分别比较了乙腈流动相分离效果和洗脱能力都强于甲醇流动相，且部分成分不出现拖尾现象，实验发现加入0.1%醋酸有利于改善色谱峰的分离度和出峰峰型。

研究中发现白芍与桂枝不同比例配伍后，与单味白芍相比均明显提高白芍中各成分的煎出率。芍药苷在酸性条件下稳定，pH对芍药苷的溶解度有一定的影响。在pH 2.5～5范围内，芍药苷的溶解度随pH值的增加而增大，pH 5.0～6.8范围内，随pH值的增加而减小，其中芍药苷在pH 5.0时溶解度最大[19-20]。由于桂枝白芍對水煎液中含有原儿茶酸、没食子酸、肉桂酸等有机酸和芍药总苷类物质，因此在一定程度上降低了水煎液中pH值，有利于增加芍药苷等成分的溶解度，从而提高各成分的煎出率。桂枝白芍三种不同比例配伍产生有机酸含量的不同及溶液pH值的改变，可能是引起芍药苷等成分煎出率差异的主要原因之一。

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（收稿日期：2017-01-04 本文编辑：张瑜杰）