莲子心总碱毒性和对四氯化碳急性肝损伤的保护作用

彭燕+杨小青+张翔+戴谆+宋金春

[摘要] 目的 探讨莲子心总生物碱毒性及对四氯化碳急性肝损伤的保护作用。 方法 一次性给予给药组昆明小鼠（10只）口服灌胃量2000 mg/kg莲子心总碱，对照组昆明小鼠（10只）给予同等剂量0.3%羧甲基纤维素钠，密切觀察72 h内两组小鼠的表现中毒症状以评价其急性毒性。SD大鼠随机分为6组，分别作为空白对照组，模型组，阳性对照组（水飞蓟素200 mg/kg），莲子心总生物碱低、中、高剂量（100、200、400 mg/kg）组，以四氯化碳为诱导剂进行肝损伤诱导，造模24 h后再禁食16 h，检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，肝组织匀浆液中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）活性，同时测定肝脏系数，并观察肝脏组织病理切片。 结果 对于昆明小鼠莲子心总生物碱安全剂量可高达2000 mg/（kg·d）。100、200、400 mg/kg莲子心总生物碱可改善模型组大鼠肝脏系数，逆转受损大鼠血清中ALT、AST、ALP以及TBIL水平（P < 0.05），恢复受损肝组织中氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的含量，降低MDA水平（P < 0.05），各指标变换趋势与剂量呈相关性。 结论 莲子心总生物碱具有较高的安全性以及对急性肝损伤具有保护作用。

[关键词] 莲子心；总生物碱；抗氧化；急性肝损伤

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（a）-0025-05

Toxicity of Lotus plumule and its hepatoprotective for carbon tetrachloride leading acute hepatic damage

PENG Yan YANG Xiaoqing ZHANG Xiang DAI Zhun SONG Jinchun

Department of Pharmacy， Renming Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To discuss toxicity of Lotus plumule and its hepatoprotective for carbon tetrachloride leading acute hepatic damage. Methods Kunming mice （n=10） in drug group received 2000 mg/kg TALP， while Kunming mice in control group （n=10） received 0.3% sodium carboxymethyl cellulose at the same dose， then poisoning symptoms of mice were closely observed in 72 h and acute toxicity was evaluated. SD rats were randomly divided into 6 groups： blank control group， model group， positive control group （silymarin 200 mg/kg）， Lotus root total alkaloids low， medium and high dose group （100， 200， 400 mg/kg）， carbon tetrachloride induced acute liver injury， after molding 24 h and fasted for 16 h， the levels of serum alanine aminotransferase （ALT）， alkaline phosphatase （ALP）， total bilirubin （TBIL） and aspartate aminotrans ferase （AST） in serum，and the content of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione over activity of peroxidase （GSH-PX） and the content of malondialdehyde （MDA） were determined， the liver organ coefficient was also measured and pathological sections of the liver were observed. Results For Kunming mice， Lotus total alkaloid safe dose was as high as 2000 mg/（kg·d）. Liver organs coefficient of rats could be improved with 100， 200 and 400 mg/kg Lotus total alkaloid. The ALT， AST， ALP and TBIL in serum of injured rats were reversed （P < 0.05）， the SOD， CAT， GSH-Px recovered， and MDA contents reduced （P < 0.05）， changes tendency of index was related with dosage. Conclusion Lotus total alkaloid has high safety and protective effect on acute liver injury.

[Key words] Lotus plumule； Total alkaloids； Antioxidation； Acute liver injury

肝损伤是由多因素多环节所造成的肝细胞代谢状态、生理功能以及组织结构发生变化，主要表现为肝组织坏死、脂肪花、纤维化等，严重者可发展为肝癌[1-3]。目前临床上采用治疗肝损伤的药物以化学药物为主，但化学药物存在单一用药效果不好，联合用药增加肝脏代谢负荷的矛盾[4-5]，使其应用受限。因此，从天然产物中提取有效成分，挖掘治疗肝损伤的新药物已成为目前研究保护肝损伤药物的热点之一。

莲子心（Lotus plumule）为睡莲科莲成熟种仁中的绿色胚芽，其主要成分之一为总生物碱（total alkaloids extracted from lotus plumule，TALP）。研究表明TALP具有广泛的药理学活性：如降压，抑菌，降血脂、抑制肥胖，抗血栓作用，抗心律失常效应等[6-10]。同时，已有研究者指出甲基莲心碱可逆转肝癌细胞对阿霉素的耐受性[11]。但目前关于TALP的体内肝保护研究较少。因此，本研究采用大鼠模型，研究TALP对体内肝损伤是否具有保护作用，以期为找出适宜的肝保护制剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

莲子心总生物碱（TALP），本实验室自制，HPLC检测含量甲基莲心碱（76.88±2.31）%，莲心碱含量为（8.37±1.21）%，异莲心碱含量为（11.24±1.45）%，0.5%二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；四氯化碳，天津市永大化学试剂开发中心。水飞蓟素对照品（批号：100281-200903，中国药品生物制品检定所），余下试剂均为分析纯级别（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 实验仪器

Bayer ADVIA2400全自动生化分析仪（德国西门子），倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康）；成像系统（Nikon DS-U3，日本尼康）。其他一些常规实验仪器设备。

1.3 实验动物

健康昆明（KM）小鼠（18±2）g，20只，雌雄各半。Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（200±20）g，60只。均从武汉大学动物实验中心购买（合格证：00003839、SCXK （鄂）2014-0013）。

1.4 方法

1.4.1 小鼠急性毒性试验

KM小鼠根据性别以及重量自然分组分为对照组与给药组，10只/组。给药组一次性灌胃给予TALP最大剂量为2000 mg/kg，对照组以同样容积0.3% CMC-Na灌胃给药，给药后小鼠，72 h内密切观察自由正常饮食KM小鼠死亡率、日常行为、精力状况以及饮食情况。

1.4.2 大鼠急性肝损伤试验

适应环境后，将SD大鼠随机分为6组，10只/组，分别为空白组、模型组、阳性对照组，莲子心总生物碱低、中、高剂量组。其中，空白组、模型组大鼠口服灌胃给予0.3% CMC-Na剂量为1 mL/kg，大鼠口服灌胃给予200 mg/kg水飞蓟素（0.3% CMC-Na溶解）；莲子心总生物碱低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予100、200、400 mg/kg TALP（0.3% CMC-Na溶解），6组大鼠分别持续灌胃11 d，1次/d。第11天，继各组大鼠灌胃给药1 h后，模型组、阳性对照组、莲子心总生物碱低、中、高剂量组分别腹腔注射50%橄榄油-四氯化碳溶液（注射剂量为2 mL/kg），同时，空白组大鼠腹腔注射同等剂量橄榄油（2 mL/kg）。试验期间，每天记录大鼠体重，密切观察大鼠饮食量。继腹腔注射50%四氯化碳 24 h后，将所有实验大鼠禁食16 h后，心脏采血，血样于3500 r/min，4℃，離心15 min，取上清液用于生化指标的检测。分离全部肝脏，制成10%匀浆液，并于4000 r/min，4℃，离心10 min，取上清作为肝脏匀浆液于-20℃冰箱中保存待用。

1.4.3 检测指标及方法

1.4.3.1 脏器系数测定 待肝脏于纱布上滤干后，迅速采用分析天平称重，计算肝脏的脏器系数。脏器系数（%）=脏器体重（g）/大鼠体重（g）×100%。

1.4.3.2 血清生化指标检测 检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）4个指标。

1.4.3.3 肝组织匀浆液中氧化指标检测 分别按照试剂盒说明方法测定肝脏匀浆液中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA活性。

1.4.3.4 肝脏组织病理切片观察 取一小块，采用4%多聚甲醛固定肝脏，送检测部门制作病理切片，苏木精-伊红染色（HE染色），于光学显微镜下观察肝脏组织形态学变化。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性试验

给药组小鼠均未表现出中毒死亡迹象。与对照组相比，给药组小鼠72 h内精神状态明显下降，日常活动量显著减少，表现为嗜睡、闭眼、食欲减少、弓背。72 h后观察，给药组小鼠逐步恢复正常生活，饮食正常，活动量增加，可推断72 h后莲子心总生物碱对小鼠正常生活无影响。

2.2 四氯化碳致大鼠急性肝损伤

2.2.1 脏器系数

TALP对大鼠肝脏系数的影响结果详见表1。与空白组大鼠比较，模型组，阳性对照组，莲子心总生物碱低、中、高剂量组大鼠，肝脏器系数均显著性增加（P < 0.05）。与模型组组大鼠比较，空白组以及阳性对照组，莲子心总生物碱中、高剂量组大鼠肝脏系数显著性下降（P < 0.05）。

2.2.2 莲子心总生物碱对大鼠血清生化指标影响

与空白组组大鼠比较，模型组大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL含量均明显地上升（P < 0.05）；与模型组大鼠比较，阳性对照组以及莲子心总生物碱低、中、高剂量组大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL含量均明显下降（P < 0.05），且呈现剂量依赖性；口服中、高剂量莲子心总生物碱大鼠血清中AST、ALP、TBIL水平与空白组大鼠比较，三项指标差异无统计学意义（P > 0.05）；阳性对照组以及低剂量莲子心总生物碱大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平均显著性高于空白组大鼠（P < 0.05）。见图1。

与空白组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P< 0.05；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；ALP：碱性磷酸酶；TBIL：总胆红素；GroupⅠ：空白组；GroupⅡ：模型组；GroupⅢ：阳性对照组；GroupⅣ：莲子心总生物碱低剂量组；GroupⅤ：莲子心总生物碱中剂量组；GroupⅥ：莲子心总生物碱高剂组

图1 莲子心总生物碱对大鼠血清生化指标影响

2.2.3 莲子心总生物碱对大鼠肝组织匀浆液中氧化指标的影响

与空白组大鼠比较，模型组大鼠肝组织中SOD、CAT、GSH-Px含量均显著性降低（P < 0.05），而MDA含量显著性升高（P < 0.05）。与模型组大鼠比较，经给药后，阳性对照组，莲子心总生物碱低、中、高剂量组大鼠肝脏组织中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA水平均出现显著性逆转情况（P < 0.05）。与空白组大鼠比较，莲子心总生物碱低、中、高剂量组大鼠肝组织中SOD、CAT、GSH-Px含量均升高、MDA含量降低（P < 0.05）；莲子心总生物碱低、中、高剂量组比较，肝组织中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA水平变化均表现出显著性的剂量依赖性（P < 0.05）。

与空白组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；GroupⅠ：空白组；GroupⅡ：模型组；GroupⅢ：阳性对照组；GroupⅣ：莲子心总生物碱低剂量组；GroupⅤ：莲子心总生物碱中剂量组；GroupⅥ：莲子心总生物碱高剂组；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化酶；MDA：丙二醛

2.2.4 莲子心总生物碱对大鼠肝脏组织形态学的影响

与空白组比较，模型组大鼠肝组织发生显著性病变，口服灌胃给予水飞蓟素、莲子心总生物碱大鼠肝脏组织形态与模型组比较，均出现明显好转。且随总生物碱剂量增大，细胞核边缘可见，细胞间隙也更加清晰。见图3。

3 讨论

3.1 TALP对小鼠急性毒性作用研究

本研究采用最大量法研究72 h内TALP对KM小鼠的影响。一次性给药后72 h内给药组小鼠尤其在服药2 h内活动量显著减少，推测其可能原因在于过多剂量的药物对小鼠消化产生一定负担，而且莲子心总生物碱味苦，在服药初期会对小鼠精神以及生理活动造成一定影响。72 h后，给药组小鼠活动与对照组小鼠一致，说明TALP对小鼠无毒性作用，口服安全剂量可高达2000 mg/（kg·d），为TALP的后期应用提供安全性评价数据。

3.2 TALP对四氯化碳致肝损伤的保护作用

四氯化碳用于大鼠急性肝损伤造模是现在应用较为广泛的一种模式去探讨肝脏受损的原理以及筛选安全有效的治疗药物。研究报道四氯化碳致肝毒性是由于肝毒性代谢物以及自由基引起，其机理与诱发人多种肝损伤机制类似。本研究采用50% 四氯化碳（橄榄油溶解，V/V）一次性腹腔注射具有操作简单，周期短，无實验动物死亡的优点[12-13]。

根据TALP对受损大鼠肝脏系数的影响结果，结果表明TALP与水飞蓟素具有减轻肝组织肥大、降低脏器系数的作用。ALT、AST、ALP以及TBIL水平是临床上常用于评价急性肝脏疾病的生化指标。模型组大鼠血清中上述4项指标[14-17]与空白组相比，显著性升高（P < 0.05），提示肝细胞受到损害，细胞膜通透性增加，结合图3可证实亦示本研究中四氯化碳致急性肝损伤模型成功。与模型组大鼠相比，给予山飞蓟素和莲子心总生物碱的大鼠血清中上述4指标均显著降低（P < 0.05），说明TALP对生化指标的影响具有与水飞蓟素相似的趋势，可初步证实亦示TALP具有保护肝脏的作用。TALP对受损大鼠体内上述四种酶变化的逆转效应，提示总生物碱可通过提高SOD、CAT、GSH-Px水平，同时降低MDA活性，清除自由基，抑制肝细胞脂质过氧化，以降低肝细胞的损伤程度。

临床上常通过病理切片观察肝组织形态学变化来直观判断肝组织损伤情况[18]。根据图3A、B对比可发现本研究采用腹腔注射50%四氯化碳造模成功致大鼠产生急性脂肪肝。通过对比图3C、D、E、F，发现给药后，肝组织中脂肪病变部位明显得到改善，TALP与水飞蓟素具有相同的护肝作用。说明TALP具有抑制组织过氧化的作用，此结论与前期所做的工作测定氧化酶活性变化一致[19-20]。

本研究首次将TALP作用于急性肝损伤大鼠模型中，以考察TALP体内肝保护作用。结果表明，TALP具有广泛的安全性，安全剂量可高达2000 mg/（kg·d）。同时，100、200、400 mg/kg TALP可通过恢复受损肝组织中氧化酶的活性，清除自由基，抑制肝细胞脂质过氧化达到有保护肝脏的作用，且400 mg/kg TALP对急性肝损伤的大鼠修复作用最强，为后期进一步作为护肝药物的遴选提供理论依据。

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