LGR5参与了肝癌上皮间质转化

邹来宾 王健 吴佳勉 嵇腾飞 曹天生

LGR5参与了肝癌上皮间质转化

邹来宾 王健 吴佳勉 嵇腾飞 曹天生

目的研究LGR5与原发性肝癌侵袭转移过程中上皮间质转化（EMT）间的关系。方法采用免疫组织化学的方法（SP法）分别检测20例原发性肝癌组织、20例癌旁组织及14例正常肝组织中LGR5、E⁃钙粘蛋白（E⁃CAD）及N⁃钙粘蛋白（N⁃CAD）的表达情况。并分析它们与原发性肝癌临床病理参数的关系。结果①LGR5、E⁃CAD、N⁃CAD的表达：在20例肝癌组织中，LGR5、E⁃钙粘蛋白、N⁃钙粘蛋白的阳性表达分别为15例（75%）、7例（35%）及16例（80%）。在20例癌旁组织中，阳性表达分别为11例（55%）、11例（55%）及10例（55%）。在14例正常肝组织中，阳性表达分别为例4（29%）、11例（79%）及4例（29%）。统计分析表明，LGR5在肝癌中的阳性表达率均明显高于癌旁及正常组织（Ρ＜0.05）。而E⁃钙粘蛋白在肝癌中的阳性表达率则明显低于癌旁及正常组织中的阳性表达（Ρ＜0.05）。同时，N⁃钙粘蛋白在肝癌中的阳性表达率明显高于癌旁及正常组织（Ρ＜0.05）。②LGR5、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白在原发性肝癌中的表达与临床病例参数的关系：LGR5的表达与患者术前肝功能有关（Ρ＜0.05），而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化、甲胎蛋白等无关（Ρ＞0.05）；E-CAD的表达与术前肝功能、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化、甲胎蛋白等均无关（Ρ均＞0.05）；N-CAD的表达与患者的术前肝功能、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化、甲胎蛋白等均无关（Ρ均＞0.05）。结论原发性肝癌中存在明显的上皮间质转化现象；LGR5与原发性肝癌侵袭转移过程中上皮间质转化有关，可能是通过Wnt/β⁃catenin信号传导通路介导原发性肝癌的上皮间质转化。

LGR5；原发性肝癌；上皮间质转化；关系

0 引言

随着医学技术的不断发展，原发性肝癌的诊疗技术不断提高，患者的平均生存时间有所延长，但其死亡率仍居高不下，5年生存率依然维持在较低水平（约为5%）。导致这一结果最主要的原因是原发性肝癌易早期出现复发及转移，而这也是导致肝癌临床治疗失败的根本原因。因此，对于原发性肝癌侵袭转移的作用机制的研究具有重要意义。而目前上皮间质转化已被证实为肿瘤细胞发生侵袭转移的重要表型，其对多种肿瘤细胞的侵袭转移具有重要作用［1，2］。E⁃钙粘蛋白（E⁃cad⁃herin，E⁃CAD）、N⁃钙粘蛋白（N⁃cadherin，N⁃CAD）作为上皮间质转化（epithelial⁃mesenchymal transi⁃tion，EMT）的特征性分子标记物，其在肿瘤中的表达可发生明显改变。这提示我们可以通过检测上皮表型E⁃CAD及间质表型N⁃CAD的表达情况来研究肿瘤侵袭转移过程中上皮间质转化现象。富含亮氨酸重复序列G⁃蛋白偶联受体5（leucine⁃rich repeat⁃containing G⁃protein⁃coupled receptor 5，LGR5）是G蛋白偶联受体超家族视紫红质亚家族的成员［3］。研究发现，LGR5在肿瘤的发生发展及肿瘤细胞的信号传导过程中具有重要作用［4］。但LGR5在肿瘤的发生发展中作用的机制还不十分清楚，LGR5在原发性肝癌侵袭转移过程中通过诱导EMT的过程也不十分清楚。本实验通过免疫组化的实验方法检测LGR5、E⁃CAD及N⁃CAD在原发性肝癌组织中的表达情况，从而探讨LGR5与原发性肝癌EMT的关系，希望能为原发性肝癌的诊治、预防提供新的理论基础与实验依据。

1材料与方法

1.1 一般资料

20例肝癌组织及癌旁组织均取自花都区人民医院普通外科2011年7月-2016年6月的原发性肝癌手术患者，而14例正常肝组织取自花都区人民医院普通外科肝血管瘤患者，且均经我院病理科证实。其中男性患者16例（80%），女性患者4例（20%）；年龄为36～68岁，中位年龄约为（48.4±11.3）岁。TNM肿瘤分期，Ⅰ期患者16例（80%），Ⅱ期患者2例（10%），Ⅲ期患者1例（5.0%），Ⅳ期患者1例（5.0%）；病理分级Ⅰ级患者1例（5.0%），Ⅱ期患者19例（95%）。同时患者均为首次发病住院治疗，术前均未接受与原发性肝癌有关的处理。所有的组织标本用福尔马林固定，并进行石蜡包埋，制成组织蜡块，便于保存。同时收集患者的临床病理资料包括患者的年龄、性别、术前肝功能、术前甲胎蛋白、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化等。S⁃P免疫组织化学超敏试剂盒、DAB显色试剂盒、抗人E⁃钙粘蛋白单克隆抗体、N⁃钙粘蛋白抗体、LGR5抗体、GR抗体均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2 实验步骤

取出石蜡包块进行连续切片，切片贴于载玻片上，然后放入70℃的烘箱中烤片熔蜡，常规脱蜡至水后将切片放入3%过氧化氢溶液中10min灭活内源性过氧化物酶，然后用微波修复法修复切片组织标本中的抗原；将50μL羊非免疫血清滴加至切片上37℃孵育15min，倾去上层血清并将已稀释的一抗工作液（E⁃CAD、N⁃CAD、LGR5抗体稀释比例均为1∶150）50μL滴加至切片上4℃冰箱孵育过夜，然后将50μL生物素标记二抗滴加至切片组织上温箱37℃孵育15min，然后滴加50 μL链霉菌抗生物素⁃过氧化物酶至切片组织上37℃温箱孵育15min，滴加DAB显色剂至切片组织上显色3分钟并置入苏木素染液中进行复染，置入1%的盐酸乙醇溶液30 s进行分化固定，最后将组织标本进行脱水、透明，并用中性树胶进行封片。另外，实验同时设置阴性对照组及阳性对照组。以PBS液代替一抗作为阴性对照组，以切片中已知抗原作为阳性对照组。

1.3 结果评判

切片由我院2名病理科医生在光学显微镜下进行观察并计数，每张切片随机选取5个高倍镜（400×）视野，每个高倍镜视野计数100个细胞，然后再计算出每张切片中阳性细胞所占的百分比。阳性细胞评判标准及染色强度：淡黄色至黄褐色不同程度着色的细颗粒状，且无非特异性背景染色，其中不染色计为0分，浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，而黄褐色计为3分。根据阳性细胞所占百分比将其分为四个等级：小于等于5%计0分，大于6%且小于等于25%计1分，大于26%且小于等于50%计2分，大于51%且小于等于75%为3分，而大于等于75%计4分，将染色强度及等级得分相乘计算出最终得分，分数达到4分为阳性表达，低于4分为阴性表达［3］。

1.4 统计学方法

运用统计软件SPSS 17.0对数据进行统计学分析。检验水准按α=0.05，而Ρ＜0.05为具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 LGR5、E⁃CAD、N⁃CAD的表达

在所有20例肝癌组织中，LGR5、E⁃CAD、N⁃CAD的阳性表达分别为15例（75%）、7例（35%）及16例（80%）（见表2-1）。在20例癌旁组织中，LGR5、E⁃CAD、N⁃CAD的阳性表达分别为11例（55%）、11例（55%）及10例（55%）（见表2-1）。在14例正常肝组织中，LGR5、E⁃CAD、N⁃CAD的阳性表达分别为例4（29%）、11例（79%）及4例（29%）（见表2-1）。统计分析表明，LGR5在肝癌中的阳性表达率明显高于癌旁及正常组织中的阳性表达率（Ρ＜0.05）（见表2⁃1）。E⁃CAD在肝癌中的阳性表达率明显低于癌旁及正常组织（Ρ＜0.05），而N⁃CAD在肝癌中的阳性表达率明显高于癌旁及正常组织（Ρ＜0.05）（见表2-1）。

表2⁃1 LGR5、E⁃CAD、N⁃CAD的表达情况

2.2 LGR5、E-CAD、N-CAD在原发性肝癌中的表达与临床病例参数的关系

LGR5在原发性肝癌中的表达与患者术前肝功能相关（Ρ＜0.05）（见表2-2），而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、肿瘤分级、HBV、肝硬化、AFP差异无统计学意义（见表2-2）。ECAD的表达与术前肝功能、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化、甲胎蛋白等均无关（Ρ均＞0.05）；N-CAD的表达与患者的术前肝功能、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化、甲胎蛋白等均无关（Ρ均＞0.05）。（见表2-2）。

表2⁃2 LGR5、E⁃CAD及N⁃CAD与临床病理参数间的情况（n）

图1 E⁃CAD免疫组化图片

图1⁃2 E⁃CAD免疫组化图片

图1⁃3 N⁃CAD免疫组化图片

图1⁃4 LGR5免疫组化图片

3 讨论

肿瘤的侵袭转移是指癌细胞从其原始位置脱落，侵袭正常组织并逐渐向周边蔓延，并通过血液、淋巴结等途径转移到其他地方定植，然后逐渐长出同源肿瘤的过程［4］。其具体过程非常复杂，是由多种因素、多个环节相互作用的结果。而原发性肝癌的侵袭转移过程主要包括肿瘤细胞与细胞间的粘附能力下降、细胞外基质结构的破坏、肿瘤细胞的远处移动及肿瘤细胞定植后形成新生血管等多个过程，而每个过程又受到许多调节因素的干扰。首先是粘附过程，肝癌细胞可向周围组织伸出伪足，然后通过伪足与细胞外基质成分发生粘附；肝癌细胞间的粘附力下降、肝癌细胞与细胞基质间的粘附力增强是原发性肝癌发生侵袭转移的重要因素。其次是降解过程，肝癌细胞可诱导各种因子的表达，产生大量水解酶，从而降解细胞外基质、局部破坏基底膜，导致细胞移出。然后是移动过程，从基底膜移出的癌细胞可以纵深移动，同时由于癌细胞获得良好的细胞运动能力，导致癌细胞向远处转移。最后是新生血管形成过程，肝癌细胞不断生长、增殖需要肿瘤血管形成，同时新生转移灶的形成也依赖肿瘤血管。而EMT是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要表型，其参与肿瘤侵袭转移的多个环节。EMT是指上皮细胞表型逐渐向间质细胞表型转化的过程［5］。在EMT过程中，上皮细胞失去细胞极性、细胞间连接消失、细胞骨架重组、从而失去细胞间黏附作用、外形演变为纺锤形纤维细胞形态、变成间质样表型；细胞与基质间的粘附作用增强导致细胞迁移和运动能力增强，细胞穿透基底膜从原发部位游离，迁移到周边组织或进入循环系统；同时细胞表型也发生了改变：上皮表型（E⁃CAD）表达下调，间质表型（N⁃CAD）表达上调［6-9］。

而本实验研究发现，E⁃CAD在肝癌组织中的阳性表达（35%）明显低于癌旁（55%）及正常肝组织（79%），而N⁃CAD在肝癌组织中的阳性表达（80%）明显高于癌旁（55%）及正常肝组织（29%）；这与肿瘤细胞侵袭转移过程中上皮间质转化的特征相符；这充分说明原发性肝癌细胞中存在上皮间质转化现象。同时本实验研究还发现，LGR5在肝癌组织中的阳性表达（75%）明显高于癌旁（55%）及正常肝组织（29%）（Ρ＜0.05）。这说明LGR5参与了原发性肝癌侵袭转移过程中的上皮间质转化，但其具体作用机制仍不完全清楚。Yamamoto［8］等应用实时定量RT⁃PCR技术检测LGR5mRNA的表达情况，结果显示其在原发性肝细胞癌中出现明显过度表达，同时发现LGR5在肝癌中的过度表达常伴随着β⁃连环素基因片段中第三外显子突变。而β⁃连环素是Wnt/β⁃catenin信号传导通路中最关键的效应物。这说明LGR5可能与β⁃连环素有关，LGR5可能是通过Wnt/β⁃catenin信号传导通路参与肿瘤的上皮间质转化［10，11］。在Wnt/β⁃catenin转导通路中，Wnt蛋白与卷曲蛋白受体（Fizzled）结合，使活化的Fizzled作用于细胞浆的蓬乱蛋白，从而使结肠腺瘤样息肉蛋白（APC）/轴蛋白（axin）/3b糖原合成激酶（GSK⁃3b）复合体失去稳定，导致β⁃连环素磷酸化水平下降，从而引起β⁃catenin在胞浆内大量聚集，稳定的β⁃连环素进入细胞核，与T细胞因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）家族成员结合，从而调节Wnt信号通路中靶基因的表达［12，13］。

同时本课题还对LGR5、E-CAD、N-CAD与临床病理参数之间的关系进行研究。结果显示，LGR5在原发性肝癌中的表达与患者术前肝功能相关，而与患者的其他临床病理参数差异无明显统计学意义。E-CAD的表达与术前肝功能、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化、甲胎蛋白差异均无统计学意义；而N-CAD的表达与患者的术前肝功能、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、分级、HBV、肝硬化、甲胎蛋白等均无关。本实验通过免疫组化的实验方法研究了LGR5在原发性肝癌中的表达情况，为原发性肝癌的上皮间质转化作用机制提供新实验依据，同时为进一步研究肝癌的侵袭转移提供了理论依据；希望LGR5能够成为肝癌侵袭转移的一个新的作用靶点，为临床治疗原发性肝癌提供一种新的、有效的治疗手段。

［1］Chambers AF，Groom AC，Macdonald IC.Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites［J］.Nat Rev Cancer. 2002，2（8）：563-572.

［2］Fidler IJ.The pathogenesis of cancermetastasis：the‘seed and soil’hypothesis revisited［J］.Nat Rev Cancer，2003，3（6）：453-458.

［3］Kumar KK，Burgess AW，Gulbis JM.Structure and function of LGR5：an enigmatic G⁃protein coupled receptormarking stem cells［J］.Protein Sci，2014，23（5）：551-565.

［4］Effendi K，Yamazaki K，Fukuma M，Sakamoto M.Overexpres⁃sion of［J］.Liver Cancer，2014，3（3-4）：451-457

［5］Bagnato A，RosanòL.Epithelial⁃mesenchymal transition in ovarian cancer progression：a crucial role for the endothelin axis［J］.Cells Tissues Organs，2007，185（1-3）：85-94.

［6］Guarino M.Epithelial⁃mesenchymal transition and tumour inva⁃sion［J］.Int JBiochem Cell Biol，2007，39（12）：2153-2160.

［7］Guarino M，Rubino B，Ballabio G.The role ofepithelial⁃mesen⁃chymal transition in cancer pathology［J］.Pathology，2007，39（3）：305-318.

［8］Tania M，Khan MA，Fu J.Epithelial tomesenchymal transition inducing transcription factors and metastatic cancer［J］.Tu⁃mour Biol，2014，35（8）：7335-7342.

［8］Ghahhari NM，Babashah S.Interplay between microRNAs and WNT/β⁃catenin signalling pathway regulates epithelial⁃mesen⁃chymal transition in cancer［J］.Eur JCancer，2015，51（12）：1638-1649.

［9］Yamamoto Y，Sakamoto M，Fujii G，et al.Overexpression of orphan G⁃protein⁃coupled receptor，Gpr49，in human hepatocel⁃lular carcinomaswith beta⁃cateninmutations［J］.Hepatology，2003，37（3）：528-533.

［10］Nakata S，Phillips E，Goidts V.Emerging role for leucine⁃rich repeat⁃containing G⁃protein⁃coupled receptors LGR5 and LGR4 in cancerstem cells［J］.CancerManag Res，2014，6：171-180.

［11］Pai SG，Carneiro BA，Mota JM，et al.Wnt/beta⁃catenin path⁃way：modulating anticancer immune response［J］.J Hemato⁃lOncol，2017，10（1）：101.

［12］宋竹雯，魏潇凡，高建超，等.LGR5在肝癌细胞及肝癌组织中的表达及意义［J］.解剖学报，2011，42（6）：802-806.

［13］Yang L，TangH，KongY，etal.LGR5 promotesbreastcancerpro⁃gressionandmaintainsstem⁃likecells throughactivationofWnt/β⁃cateninsignaling［J］.Stem Cells，2015，33（10）：2913-2924.

“第二届岭南逸仙颅底外科学术论坛”成功举办

第二届岭南逸仙颅底外科学术论坛于2017年6月3日在广州成功举行。本次会议由广东省医师协会主办，中山大学孙逸仙纪念医院承办，由广东医师协会神经外科分会主任委员、中山大学附属第一医院神经外科主任王海军教授担任大会主席，由中山大学孙逸仙纪念医院神经外科主任、广东医学会神经外科颅底鞍区学组副组长邓跃飞教授担任大会执行主席，共邀请14位来自台湾、北京、上海等地方的颅底外科专家学者到会发言和担任点评嘉宾，参会人员200余人。

广东医师协会常务副会长吴少林、上海华山医院神经外科主任钟平教授、北京中日友好医院神经外科主任于炎冰教授、中南大学湘雅二院神经外科主任蒋宇刚教授、中山大学附属第三医院神经外科主任郭英教授、广东省人民医院神经外科主任周东教授、广州军区总院神经外科主任王国良教授、广州市第一人民医院主任曹志恺教授以及来自中国台湾的许秉权教授等。

会议就鞍结节脑膜瘤、复杂颅底沟通瘤、海绵窦肿瘤、颅底复杂脑膜瘤、垂体瘤、颅咽管瘤、脑干肿瘤等方面作了主题演讲与讨论。一、总结了鞍结节鞍膈脑膜瘤的手术经验：会议期间，钟平教授回顾了鞍膈脑膜瘤治疗的发展历程，介绍了上海华山医院运用多种入路切除鞍结节鞍膈脑膜瘤的一系列经验。二、明确了脑干肿瘤的手术治疗价值：蒋宇刚教授通过对脑干肿瘤的系统性研究，提出了当前脑干肿瘤的手术治疗意义以及未来的研究和发展方向。三、国际上首次提出了复杂颅底肿瘤的新的分型：邓跃飞教授总结多年手术经验，结合大量临床病例，对复杂颅底沟通肿瘤提出了新的临床分型，在临床手术中具有较强的实用性和指导意义；四、鞍区及鞍旁病变也是此次会议的讨论焦点之一，钟平教授、许秉权教授、潘军教授、毛志刚分别就鞍膈脑膜瘤、海绵窦区肿瘤、海绵窦肿瘤、颅咽管瘤、垂体瘤等进行了专题阐述。五、新理念、新技术在神经外科中的最新应用：贺世明教授详细阐述了ERAS（加速康复外科）的临床价值及在神经外科中的发展；伍益主任就3D-slicer图像融合技术在颅底外科手术中应用，进行了实例展示；六、内镜技术的全面提升：内镜技术在此次会议期间得到重点关注，郭英教授提出应将开颅手术和内镜手术相结合，取长补短；黄国栋教授通过内镜经鼻治疗颅底肿瘤的成功经验，进一步强化了对颅底重建的认识，通过大量病例数据和典型手术录像，具体介绍了神经内镜等微创技术在颅底肿瘤中的应用。七、推动了颅底外科多学科协作的进一步发展：中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科陈伟良教授的研究使得颅底外科的治疗更加丰富，启发了思路。（来源：中山大学孙逸仙纪念医院官网，http://www.syshospital.com/ Item/334088.aspx）

LGR5 involves in epithelial⁃mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma

ZOU Laibin， WANG Jian，WU Jiamian，JI Tengfei，CAO Tiansheng.Department of General Surgery，The people HospitalofHuadu District，Guangzhou 510800，China.

Objective To research the relationships between Orphan G⁃protein⁃coupled Receptor（LGR5）with epithelial⁃mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma.M ethods To test the expression of LGR5，E⁃CAD and N⁃CAD in 20 HCC tissues，20 paracancerous tissues of HCC and 14 normal liver tissues by immunohistochemistry and to analyze the expressions of them with some clinic⁃pathological parameters.Results In 20 HCC specimens，the positive expressions of LGR5，E⁃CAD and N⁃CADwere 15 cases（70%），7 cases（35%）and 16 cases（80%）respectively.In 20 paracancerous tissues of HCC specimens，the positive expressionswere 11 cases（55%），11 cases（55%）and 10 cases（55%）.While in all14 cases ofnormal liver tissues，the positive expressions are 4 cases（29%），11 cases（79%），4 cases（29%）respectively.Statistical analysis showed that the positive expression rate of LGR5 in HCC were obviously higher than that in paracancer and normal liver（Ρ＜0.05）.The expression of LGR5 was correlated with liver function（Ρ＜0.05），butno statistically significantwith age，gender，tumor size，tumor TNM stages，pathologicalgrades，HBV and liver cirrhosis serum alpha fetoprotein（Ρ＞0.05）. There was no statistical significance between the expression of E-CAD with the function of liver，age，gender，tumor size，tumor TNM stages，pathological grades，HBV and liver cirrhosis serum alphafetoprotein（all P＞0.05）；The expression of N-CAD wasnot correlated with liver function，age，gender，tumor size，tumor TNM stages，pathological grades，HBVand liver cirrhosis serum alpha fetoprotein（all Ρ＞0.05）.Conclusion Primary livercanceroccurshasobviousEMTphenomenon.LGR5 is related to EMT of invasion and metastasis in primary liver cancer and itmay be able tomediate EMT in primary liver cancer through theWnt/β⁃catenin signal pathway.

LGR5；hepatocellular carcinoma；epithelial⁃mesenchymal transition；relationship

R735.7

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.03.006

2017-03-10）

广东省科技计划项目（2012B02070004)

510800广州广州市花都区人民医院

邹来宾，Email：675214235@qq.com