基因NEK9在肝细胞癌组织中的表达效应及其临床意义

陈洽铭 韦金星 李晓辉*

基因NEK9在肝细胞癌组织中的表达效应及其临床意义

陈洽铭1韦金星2李晓辉1*

目的研究基因NEK9在肝细胞癌组织中的表达效应，并探讨其表达量与其临床病理参数的关系。方法收集从2010～2011年我院60例原发性肝细胞癌患者肝癌组织及其配对癌旁组织，并统计分析其临床病理资料；同时采用荧光定量PCR、免疫组化方法检测肝癌组织和癌旁组织中NEK9基因和蛋白的表达水平，分析NEK9的表达量与其相对应临床病理参数之间的关系。结果相对于癌旁组织，肝细胞癌组织中基因NEK9的表达量在mRNA水平显著高表达（25/30）（P＜0.05），在蛋白质水平亦呈显著高表达（65%及21.7%）（P＜0.05）；癌组织中NEK9的表达水平与TNM分期、转移和复发等临床病理参数有相关性（P＜0.05）；癌组织中NEK9高表达组患者的术后无瘤生存时间较低表达组明显缩短（P＜0.05）。结论原发性肝细胞癌组织中NEK9的高表达与肿瘤大小、TNM分期、转移和复发密切相关，并有可能成为预测肝癌患者预后的生物学标志物。

原发性肝细胞癌；NEK9；肿瘤转移；复发

肝细胞癌（HCC）是世界上高发恶性肿瘤之一，尤其在中国，其发病率、死亡率严重影响国民的健康状况［1，2］。尽管目前肝细胞癌的诊疗有很大进步，包括手术、化疗、放疗等，但由于高复发、转移等特性，目前其预后仍不容乐观。近年来，分子生物学技术的进步给肿瘤的诊断和治疗提供了新思路，寻找肝细胞癌早期诊断、预后判断、确定治疗决策的分子标志物及其作用机制仍是肝癌研究的重要内容［3］。

Nek9，又称NIMA相关蛋白激酶9，为Nek家族蛋白之一［4］。在很多恶性肿瘤中，Nek蛋白激酶均出现异常表达，进而导致细胞周期的调控异常、非正常增殖，最终影响肿瘤的发生、发展。其家族蛋白Nek2、Nek6、Nek7在乳腺癌、胆管癌、卵巢癌中都有高度表达现象［5-7］，然而Nek9蛋白在肝癌中的表达、临床预后的关系及其与肿瘤发生发展、生物学行为尚未见系统报道。

本研究应用荧光定量PCR和免疫组化的方法分析原发性肝细胞癌组织中NEK9的表达情况及其与临床病理参数的相关性，并探讨其在肝癌复发、预后中可能存在的作用，为肝癌的诊断与治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 组织标本

组织标本来自2010年到2011年期间在广东普宁人民医院普外科行肝细胞癌切除术患者，经术后病理证实为原发性肝细胞癌，共计60例，所取组织为距癌灶边缘1 cm以内且无坏死的癌组织，和距癌灶边缘至少2 cm的癌旁组织，均有保存完好的新鲜冰冻组织和石蜡包埋组织。所有病例均有完整的临床资料和随访资料（5年周期）。

1.2 主要试剂

RNAiso试剂、逆转录试剂盒、荧光染料试剂SYBR Green IMaster购自日本Takara公司；NEK9兔多克隆抗体购自美国ABclonal公司，通用型二步检测法试剂盒（PV⁃3000）、二氡基联苯胺（DAB）显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 荧光定量PCR检测NEK9mRNA的表达

按照RNAiso RNA提取试剂盒说明书提取新鲜冰冻组织总RNA。以紫外分光光度计测总RNA纯度及浓度。cDNA的合成按照逆转录试剂盒操作说明书进行。荧光定量PCR实验所用引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，以GAPDH作为内参。引物序列见表1。反应体系的配制及反应条件的设置均按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行。计算得到的mRNA相对表达量数值，以中位数为截断值，将NEK9mRNA的表达水平分为低表达组和高表达组。

1.4 免疫组化检测

NEK9蛋白质的表达：石蜡标本切成约4μm切片，经常规烤片，脱蜡，水化，微波炉法抗原修复15min，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶15min，孵育一抗（1∶100）4℃过夜，次日二抗孵育1 h，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.5 免疫组化结果判定标准

NEK9蛋白质的表达部位为细胞质，我们定义细胞质被染色为浅棕色至深褐色的肝细胞为阳性细胞，先按着色强度，对癌组织进行评分：无着色记为0分，轻度着色记为1分，深度着色记为2分。然后评估阳性细胞占总体细胞的比例，记为1%～25%记为1分，26%～50%记为2分，＞50%记为3分。最后，取着色强度以及阳性细胞分布得分的乘积为肝细胞组织NEK9蛋白质的表达情况。根据免疫组化评分中位数，将肝癌组织NEK9蛋白质的表达水平分为低表达组和高表达组。

1.6 病例随访

所有病例术后经门诊和电话随访，随访时间自患者手术日起至2015年12月。3次经上述方式无法联系的患者，定为失访病例。至随访截止日期，失访2例，以最后一次联系时间为随访终点。复发的确诊根据CT、MRI、AFP升高水平、肝动脉造影和（或）组织病理学结果综合评价而定。转移的定义为：术前发生癌栓（包括门静脉、胆管、动脉癌栓）、淋巴结转移、肝外转移。

1.7 统计学方法

荧光定量PCR实验数据采用2-ΔΔCT法进行处理，采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。NEK9 mRNA及蛋白质的表达分类与临床病理参数分类之间的比较采用卡方检验。癌组织中NEK9不同表达强度的复发情况的比较采用Kaplan⁃Meier生存分析。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 NEK9mRNA在癌组织和癌旁组织中的表达

荧光定量PCR结果显示：在30例肝癌患者组织中，肝癌组织的NEK9mRNA表达水平高于其配对的癌旁组织（如图1）。

图1 NEK 9m RNA在肝癌组织中的表达情况

2.2 NEK9蛋白质在癌组织和癌旁组织中的表达

在60例肝癌患者中，39例患者的NEK9蛋白质表达为阳性（图2A、B、C），癌组织中的阳性率为65%；在60例肝癌患者的癌旁组织中，13例患者的NEK9蛋白质表达为阳性，癌旁组织中的阳性率为21.7%（表2）。说明无论是在mRNA水平还是蛋白质水平，NEK9在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.05）。

2.3 NEK9的表达与临床病理参数之间的关系

癌组织中NEK9蛋白质的表达水平与甲胎蛋白含量、肿瘤大小、TNM分期、是否发生转移、复发相关（P＜0.05），与性别、年龄、肿瘤数量等相关性无统计学意义（表3）。

图2 NEK 9蛋白质在肝癌组织中的表达情况

表2 肝癌患者癌组织与癌旁组织中NEK 9蛋白质表达水平（n）

2.4 NEK9的表达与患者预后的关系

在术后无瘤生存时间上NEK9蛋白质阳性组较阴性组的无瘤生存时间显著缩短（P＜0.05，图3）。癌组织中NEK9高表达提示预后不良。

图3 NEK 9在肝癌组织中的表达与患者术后无瘤生存曲线情况

表3 肝癌患者癌组织中NEK 9蛋白质表达水平与临床病理参数的关系（n）

3 讨论

原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，由于缺乏有效的治疗手段，其干预依旧是巨大的挑战［8］。目前肝癌的治疗手段包括：手术切除、TACE、射频消融、无水酒精注射、冷冻技术、肝移植、口服靶向药物索拉非尼及放化疗，其中手术切除及肝移植手术是目前效果比较确切、首先的治疗方案。但由于肝癌术后复发率及转移率均相对较高，其5年总生存率仅达17%到53%，确诊后的平均生存时间为6到20个月［9，10］。肿瘤的发生发展、转移是多因素、长期累积突变的过程，其发生机制可能为肿瘤的治疗带来新的希望。随着分子生物学的进步，寻找肝细胞癌新靶标成为了可能，其发现可为临床决策提供关键性指导作用［11，12］。

NIMA蛋白激酶，又称Nek家族蛋白，是1975年Morris发现并以构巢曲霉菌蛋白激酶命名的一种激酶，参与广泛的有丝分裂进程［13］。哺乳动物的NIMA基因编码11种NIMA激酶，作为有丝分裂进展中的关键分子，参与了许多重要的有丝分裂过程，如有丝分裂前期中的中心体分离，染色体浓缩，前中期中的核膜破裂和纺锤体组装，以及有丝分裂周期的退出和细胞骨架分离［14］。由于肿瘤细胞是一种以细胞增殖、分化以及凋亡异常为特征的疾病，其主要特点是细胞的无限增殖能力和细胞周期的异常调控。近年来，肿瘤细胞周期的调控，尤其是中心体以及其相关细胞周期相关蛋白的作用，逐渐受到关注［15］。由于NIM家族蛋白在细胞分裂中纺锤体形成、中心体形成等过程起着重要的作用，其功能亦收到广泛关注。文献表明Nek2、Nek6、Nek7等家族蛋白在乳腺癌、胆管癌、卵巢癌等多种肿瘤都有高表达现象［5-7］。然而Nek9蛋白在肝癌中的表达、临床预后的关系及其与肿瘤发生发展、生物学行为尚未见系统报道。

本研究首次发现肝细胞癌组织中NEK9的表达明显升高，且NEK9的表达水平与肿瘤大小、TNM分期、是否发生转移和复发高度相关。此外癌组织中NEK9高表达组患者，其术后无瘤生存时间相比NEK9低表达组明显缩短。因此，我们推测Nek9的高表达可能影响肝癌的复发转移，可提示患者的预后不良。

Nek9属于NIMA蛋白激酶家族，是一分子量107kD的多肽，它的氨基催化末端连接有一段与RCC1同源的序列，后者是小G蛋白Ran的交换因子。在细胞分裂间期，Nek9的RCC1区域可以直接与激酶的活性部位结合起自身抑制作用。哺乳动物细胞中发现Nek9与γ-tubulin蛋白共沉淀，并且激活的Nek9多肽在早期细胞分裂过程中定位于中心体和纺锤体极上［16，17］。文献表明，Nek9在食管癌［18］、头颈部肿瘤［19］等部位有异常表达现象，而在p53敲低的SW480肠癌细胞株［18］、胃癌细胞株［20］中，扮演着调控肿瘤细胞增殖的重要作用，这提示Nek9与肿瘤的发生发展有密切的关系。而我们研究发现Nek9的高表达与肝癌病灶的大小、复发具有高度相关性，这提示Nek9在原发性肝癌中起着促癌的作用，另外，由于NEK9蛋白激酶的表达或功能异常与肝癌的发生、发展具有高度相关性，这亦为肝癌的肿瘤的发病机制及新型治疗策略提供了进一步研究的新方向。

综合上述，原发性肝细胞癌NEK9的表达量，在mRNA水平和蛋白质水平均有高阳性率现象，其表达与肿瘤大小、TNM分期、转移以及复发等临床病理参数高度有关，生存分析亦提示NEK9高表达组患者的预后较差。因此，我们认为NEK9是一个具有提示肝癌复发转移潜在价值的新型肿瘤标志物，有助于肝癌的早期诊断、早期治疗以及预后判断，但NEK9在肝癌发生发展中的作用机制有待进一步研究。

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The expression of gene NEK 9 and its concerned clinical significance in HC C

CHEN Qiaming1，CHEN Chunna2，Wei Jinxing2，LIXiaohui1.1Department ofSurgery，Puning People′s Hospital，Puning，Guangdong 515300，China；2Department ofHepatobiliary Surgery，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：LIXiaohui，342152819@qq.com

Objective To investigate the expression of NEK9 in hepatocellular carcinoma（HCC）tissues and its correlation with clinical pathological parameters.M ethods Sixty cases of primary HCC tissues，paired normal tissues and their clinical data were collected in our hospital during 2010 to 2011.The mRNA level expression of NEK9 was determined by qRT⁃PCR.The protein expression of NEK9 was detected by immunohistochemical staining.Then the relationship of NEK9 expression and clinical pathological parameters were analyzed.Results Compared to the paired normal tissues，the expression of NEK9wasexplored to bemuch higher in primary HCC tissues，both atmRNA level（25/30）（P＜0.05），and at protein level（65%and 21.7%）（P＜0.05）.The expression of NEK9 was found to be correlated with tumor size，TNM stagemetastasis and recurrence and tumor⁃free survival time（P＜0.05）. Conclusion Theover⁃expression ofNEK9 isconcernedwith tumorsize，TNM stage，metastasis，recurrence and tumor⁃free survival time，andmaybe a potentialmarker for early diagnosis and prognosis of HCC.

hepatocellular carcinoma；NEK9；metastasis；recurrence

R735.7

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.03.003

2017-03-28）

1515300广东揭阳普宁人民医院普通外科；2510120广州中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科

*通讯作者：李晓辉，Email：342152819@qq.com