环六缩酚肽抑制人前列腺癌细胞增殖活性及作用机制①

刘丽秋，王 莉，崔国利，周奎臣，辛 华，江清林

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

环六缩酚肽抑制人前列腺癌细胞增殖活性及作用机制①

刘丽秋，王 莉，崔国利，周奎臣，辛 华，江清林

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：分析环六缩酚肽对人前列腺癌细胞(PC-3)的增殖活性作用，并对其作用机制进行研究。方法：设置空白对照组(加入0.1% 二甲基亚砜)、阳性对照组(加入奥沙利铂)和环六缩酚肽组(加入环六缩酚肽)3组，利用噻唑蓝(MTT)法测定各组人PC-3细胞的增殖率，利用TUNEL法测定各组人PC-3细胞的凋亡率，利用Westernblot法测定各组人PC-3细胞Caspase-3、bcl-2及bax蛋白表达的调控情况。结果：培养24h和48h后，阳性对照组和环六缩酚肽组人PC-3细胞增殖率为(35.8±2.78)%、(44.8±3.00)%和(32.3±1.96)%、(38.1±2.12)%，人PC-3细胞凋亡率为(45.2±3.60)%、(48.2±3.71)%和(48.3±3.07)%、(50.1±4.15)%，与空白对照组的(100.0±2.16)%、(100.0±2.61)%和(6.0±0.95)%、(6.3±1.05)%对比具有统计学差异(P<0.05)；阳性对照组和环六缩酚肽组前列腺癌细胞中bax和Caspase-3蛋白表达水平增加，bcl-2蛋白表达水平降低，与空白对照组对比具有统计学差异(P<0.05)。结论：环六缩酚肽具有抑制人PC-3细胞增殖及凋亡的作用，通过caspase-3和Bax可对PC-3细胞的凋亡进行诱导。

前列腺癌细胞；环六缩酚肽；细胞凋亡；抑制活性

生物体内活性肽为分子聚合物，介于蛋白质与氨基酸之间，在生理学上具有重要的研究价值和意义[1]。环肽的稳定性较线性多肽强，其具有多种医药价值和生理功能，因而具有广阔的临床应用前景[2]。本研究在土壤真菌中对三种环六缩酚肽化合物进行分离，并对环六缩酚肽抑制人前列腺癌细胞(PC-3)增殖活性及作用机制进行了研究，旨在为环肽类化合物的进一步运用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

本研究所选用的PullularinC、PseudodestruxinC和DestruxinB三种环六缩酚肽化合物均由河北医科大学药学院天然药物化学教研室提供；RPMI1640 培养基由上海博升生物科技有限公司提供；噻唑蓝(MTT)由上海士锋生物科技有限公司提供；TUNEL凋亡检测试剂盒(显色法)由美国MerckMillipore公司提供；Bax和β-actin抗体均由SantaCruzBiotechnology公司提供；Caspase抑制剂/凋亡抑制剂Z-VAD-FMK由上海前尘生物科技有限公司提供。人前列腺癌细胞(PC-3)由中国科学院提供，在直径100mm的培养皿中接种细胞，RPMI1640培养基中培养，添加10%胎牛血清，于5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养，温度为37℃。

1.2 方法

(1)MTT法[3]

人PC-3细胞悬浮接种于96孔板上，50μL/孔，设置空白对照组、阳性对照组、环六缩酚肽组3组，即加入0.1% 二甲基亚砜(DMSO)溶剂，加入奥沙利铂，加入环六缩酚肽；各组设3复孔，于CO2培养箱中培养24～48h。培养结束前4h，各孔添加5g·L-1MTT10μL，采用酶联免疫检测仪对吸光度值(OD值)进行测定，得出细胞增殖抑制率。

(2)TUNEL法[4]

人PC-3细胞悬浮接种于8孔玻片中，400μL/孔，20h后添加PullularinC(终浓度1μmol·L-1)。12h后，使用5%多聚甲醛(PFA)固定，pbs缓冲液浸洗；TritonX-100通透液通透后，根据操作说明书进行TUNEL法检测。随机选取5个高倍视野，记数阳性细胞数，以阳性细胞所占百分比的平均值作为细胞凋亡率。

(3)Westernblot法[5]

以2×106个细胞/培养皿接种PC-3细胞，添加阳性对照顺铂(终浓度2μmol·L-1)和PullularinC培养基培养细胞，24h后收集细胞，提取蛋白50μg，于SDS-PAGE电泳下分离、转膜，一抗、二抗后，洗膜并添加ECL试剂，利用胶片曝光显影。

1.3 统计学方法

采用统计软件TheSASsystem6.12处理数据，均数±标准差表示计量资料，进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人PC-3细胞的增殖

培养24h和48h后，阳性对照组和环六缩酚肽组人PC-3细胞增殖率降低，与空白对照组对比具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组前列腺癌细胞增殖率的对比±s，%)

2.2 人PC-3细胞的凋亡

培养24h和48h后，阳性对照组和环六缩酚肽组人PC-3细胞凋亡率增加，与空白对照组对比具有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 各组前列腺癌细胞凋亡率的对比±s，%)

2.3 人PC-3细胞Caspase-3、bcl-2及bax蛋白表达的调控

阳性对照组和环六缩酚肽组前列腺癌细胞中bax和Caspase-3蛋白表达水平增加，与空白对照组对比具有统计学差异(P<0.05)；bcl-2蛋白表达水平降低，与空白对照组对比具有统计学差异(P<0.05)。

3 讨论

前列腺癌是男性患者常见的恶性肿瘤，常规抗癌药物易产生耐药性，故寻求高效低毒的治疗药物成为临床研究的重点，其中在自然界中寻找新的抗癌活性成分也成为临床研究的热点问题之一[6,7]。本研究对人前列腺癌进行体外实验，结果发现环六缩酚酞可对人前列腺癌细胞产生一定作用，其作用明显优于奥沙利铂[8]。近几年来，多肽类物质治疗癌症的研究越来越多，已有研究证实多肽类物质治疗癌症的临床疗效十分明显，其具有不良反应少、抗癌活性强、不易产生耐药性等特点[9]。环六缩酚肽属于小分子多肽类物质，其表现为环状结构，与线性多肽相比，环六缩酚酞的性质更加稳定。在前列腺癌组培养液中添加环六缩酚肽，培养24h和48h后，环六缩酚肽组前列腺癌细胞增殖率降低、凋亡率升高，且第三代铂类抗癌药奥沙利铂与环六缩酚肽抑制前列腺癌细胞生长、促进前列腺癌细胞凋亡的作用相当，其中环六缩酚肽的作用更加明显。现有的研究结果证实：线粒体/细胞色素C/Caspase-9/Caspase-3是人体细胞凋亡的主要途径[10]，机体在接收外界信号后，通过多种信号转导通路，转导至细胞内的外界信号激活Caspase-3，激活Caspase-3使细胞核内DNA剪切，从而产生促使细胞凋亡的作用。细胞在凋亡过程中，机体会通过对Caspase-3活性的调节对细胞的凋亡进行调控，同时通过对线粒体功能进行调控也可对细胞的凋亡进行调控。线粒体功能的调控过程中，调控蛋白bcl-2和Bax的作用十分重要，然而bcl-2和Bax的作用又是完全不同的。bcl-2蛋白具有抑制细胞凋亡的作用，bcl-2和Bax结合可导致bcl-2抗细胞凋亡作用消失，而Bax则可促使细胞凋亡。本研究结果显示：阳性对照组和环六缩酚肽组前列腺癌细胞中bax和Caspase-3蛋白表达水平增加，bcl-2蛋白表达水平降低，与空白对照组对比具有统计学差异(P<0.05)。表明环六缩酚肽通过激活Caspase-3促进前列腺癌细胞凋亡，与此同时通过促进Bax表达、抑制bcl-2表达对线粒体功能进行调控，从而起到抑制前列腺癌细胞增殖活性的作用。综上所述，环六缩酚肽具有抑制人前列腺癌细胞增殖活性的作用，通过本研究所证实的上述途径可促使细胞凋亡，即通过caspase- 3、Bax、bcl-2介导诱导人前列腺癌细胞凋亡；但肿瘤细胞凋亡现象的发生是多途径共同作用的结果，所以环六缩酚肽诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制还需进一步研究。

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1.黑龙江省自然科学基金项目，编号：D201225；2.佳木斯大学科学技术重点项目，编号：12Z1201504。

刘丽秋(1978～)女，黑龙江佳木斯人，学士，主管技师。

江清林(1964～)男，黑龙江林口人，硕士，研究员，硕士研究生导师。E-mail:jqljms@126.com。

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