GST-CBX2-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达①

刘婷隽，洪泽辉，胡安康

(1.徐州医科大学实验动物中心，江苏 徐州 221004;2.东南大学基础医学院，江苏 徐州 221004)

GST-CBX2-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达①

刘婷隽1，洪泽辉2，胡安康1

(1.徐州医科大学实验动物中心，江苏 徐州 221004;2.东南大学基础医学院，江苏 徐州 221004)

目的：构建GST标签的CBX2-1融合蛋白表达载体，并在大肠杆菌中诱导表达，纯化出表达蛋白。方法：以CBX2-1全长为模板，构建3对引物，将CBX2-1PCR扩增成3段，通过XhoⅠ和NotⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-4T-3载体中，并转化E.coliDH5ɑ，通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序坚定正确后，转入E.coliBL21中，经IPTG大量诱导表达，SDS-PAGE电泳和Westernblot鉴定，运用GSTpulldown方法纯化3段蛋白。结果：酶切电泳及测序结果证明，原核表达质粒GST-CBX2-1 3个载体构建成功，用Westernblot方法证实了GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的表达，并成功纯化出3段蛋白。结论：成功构建了GST-CBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3原核表达载体，证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达与纯化，为进一步研究CBX2-1各结构域的功能提供了前提基础。

CBX2-1蛋白；原核表达；载体构建；蛋白纯化

多梳家族(PcG)蛋白可以作为组蛋白修饰激酶，通过调节染色质高级结构参与基因表达的调控[1]。研究表明，PcG成员参与不同的细胞过程，例如干细胞分化、细胞命运决定、衰老、哺乳动物或肿瘤形成过程中调节X染色体的失活[2～4]。CBX2，是Pc家族同系物，N端含有染色质结构域，C端含有高度保守的Pc盒[5，6]。在人类CBX2基因座上，含有两个转录体，一个转录体是由5个外显子组成含有532个基因的亚体CBX2-1，其包含保守的染色质结构域和Pc盒。另一个转录体CBX2-2由4个外显子组成包含211个基因，其只存在染色质结构域，没有Pc盒[7]。前人的研究发现,CBX2-1比CBX2-2表达量更高，对CBX2-1的探究更深入，于是本实验选取CBX2-1作为研究对象。为深入研究CBX2-1各结构域的功能及分子机制，我们利用分子克隆技术成功构建了CBX2-1-1、CBX2-1-2、CBX2-1-3基因原核表达载体，并在大肠埃希菌中诱导表达其融合蛋白，GSTpulldown成功纯化3段蛋白，为CBX2-1各结构域功能的研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试材料

CBX2-1模版由东南大学洪泽辉老师实验室提供；引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；RedTaqDNA聚合酶、10mmol/LdNTPs、10×PCRBuffer(Mg2+free) 、25mmol/LMgCl2、无菌双蒸水ddH2O、琼脂糖、溴化乙锭(EB)、TAE电泳缓冲液、SDS凝胶上样缓冲液、半干转转移缓冲液、Tris-Glycine电泳缓冲液。

1.1.2 引物设计

设计3对引物送南京金斯瑞公司合成，见表1。

表1 扩增目的基因的引物序列

F-1、F-259、F-601的5’端添加XhoⅠ酶切位点，R-288、R-600、R-1596的3’端添加NotⅠ酶切位点。

1.1.3 主要试剂盒

TaKaRaDNABluntingKit(DNA平滑化连接试剂盒)、TaKaRaTaqTM酶、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0(质粒提取试剂盒)和TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0(琼脂糖胶回收提纯DNA试剂盒)购自宝生物工程(大连)有限公司;RestrictionEndonuclease(限制性内切酶)与T4DNALigase(T4DNA连接酶)购自NEB(北京)生物科技有限公司、GSTResin购于南京金斯瑞公司、兔抗鼠二抗(HRP标记)购于上海Genetech公司、ECLplus购于美国GE公司。

1.1.4 主要仪器设备

MJPCR扩增仪、Eppendorf移液枪、Eeppendorf超速冷冻离心机、DYY-8C型电泳仪、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温培养箱、恒温干燥箱、低温冰箱、超低温冰箱、超净工作台、高压灭菌锅、SP-2102UV型微量紫外分光光度计、LQP-B-4颗粒测定仪(制冰机),超声机等。

1.2 实验方法

1.2.1GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白表达载体的构建

PCR扩增CBX2-13段基因，将pGEX-4T-3载体和CBX2-1 3段PCR产物分别用NotⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶双酶切，并进一步纯化，T4DNA连接酶16℃连接4h，然后涂到含有氨苄抗性的培养板上，37℃过夜，挑取白色克隆，转化到DH5α感受态细胞中，37℃、250rpm过夜培养。提取质粒后酶切及测序验证。

1.2.2 重组蛋白在原核细胞中的大量表达

将鉴定正确的重组质粒pGEX-4T-CBX2-1及pGEX-4T-3空载体转化大肠杆菌BL21,37℃、250rpm振荡培养过夜。过夜的培养液以1:50转接于含100mL新鲜培养基的锥形瓶中，37℃、250rpm振荡培养1.5～2h，使OD值达0.4～0.6。加入IPTG(终浓度为0.5mM，37℃、250rpm条件下培养8h。

1.2.3GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的纯化

诱导后的细菌在4℃、5000rpm条件下离心15min，用冰PBS洗一次，离心去上清。取沉淀菌体，向沉淀中加入8mLPBS和终浓度为1mM的PMSF，超声破碎大肠杆菌细胞，超声条件为：超10s，停10s，40%功率，15min。整个超声过程需在冰上进行，以防超声过程中蛋白质预热变性。

超声后，12000rpm，离心15min取上清，分别与GlutathioneResinbeads孵育，4℃旋转过夜，次日，3000rpm，5min，离心收集珠子。用含有500mMNacl，1%TritonX-100的PBS洗涤珠子，4℃旋转5min，共5次。离心收集珠子，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色检测纯化结果。

1.2.4 Western Blot

将纯化好的珠子，加入适量SDS loading buffer裂解，100℃、煮沸5min。12000rpm、离心15min，取上清。等量的蛋白通过12%的SDS-PAGE凝胶进行跑胶分离，并转移至PVDF膜上，用2%脱脂奶粉封闭1h，并分别用GST(1:2000)、p53(1:1000)、抗体孵育，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入HRP标记的羊抗鼠(1:2000)二抗，室温孵育2h，TBST洗膜；ECL显色、发光。

2 结果

2.1 PCR反应扩增3段CBX2-1基因

在本实验中，我们将其分为1-288,259-600,601-1596三段，分别对CBX2-1所分的3段基因进行PCR扩增，可见约288bp、342bp、997bp的特异性片段与预期相符，见图1。

2.2 GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)原核表达载体的构建及鉴定

重组质粒GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后得到相应大小的条带，见图2，与预期一致，进一步测序鉴定正确。

图1 CBX2-1的3段目的基因PCR产物电泳图

M DNA标志物；1、2、3分别为CBX2-1 3段目的基因的PCR产物

图2 GST-CBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3经XhoⅠ和NotⅠ双酶切结果电泳图

2.3 GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596) 重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达

将3个重组质粒转化至E.coli BL21中，在0.5mmol/L IPTG、30℃下，诱导表达3h，考马斯亮蓝染色后在40kDa、42kDa、68kDa附近出现明显的特异性条带，其分子量与预期相符，见图3。

图3 考马斯亮蓝染色鉴定GST-CBX2-13段蛋白在原核细胞中的表达

2.4 GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3 融合蛋白的纯化及鉴定

运用GST pull down实验原理，对CBX2-1的3段基因表达的蛋白质进行纯化，SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色后在40 kDa、42 kDa、68 kDa附近出现明显的特异性条带，其分子量与预期相符，见图4。

2.5 Western Blot检测CBX2-1的3段蛋白的纯化结果

Western Blot进一步鉴定GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3的表达，结果可见在40 kDa、42 kDa、68 kDa附近出现明显的特异性条带，见图5，说明成功表达出3段重组融合蛋白。

图4 考马斯亮蓝检测GST pull down纯化CBX2-1 3段蛋白

图5 Western Blot检测CBX2-1的3段蛋白的纯化

3 讨论

CBX2参与人类性成熟过程，它和鼠中同源蛋白M33都是PcG家族成员。研究发现[8]，与其他的前列腺癌相比，在神经性前列腺癌中CBX2作为作重要的表观遗传学上调因子。CBX2的高表达与患者的预后结果差及更严重的肿瘤表型密切相关，并符合神经性前列腺癌的临床特征。人类CBX2存在两个转录本，CBX2-1含有532个基因，CBX2-2含有211个基因。为了深入研究CBX2-1各结构域的生物学功能，构建CBX2-1的原核表达载体是关键之一。在本研究中，我们根据CBX2-1的空间结构将CBX2-1分成3段，成功构建GBX2-1-1

(1-288)，CBX2-1-2(259-600)，CBX2-1-3(601-1596)的原核表达载体，并利用IPTG进行大量诱导表达，获得GST-GBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3纯化蛋白。在载体选择上，我们采用了pGEX-4T-3载体，此类载体带有GST标签，能够增加目的蛋白的溶解度，融合蛋白可以很方便地从细菌细胞裂解液中用Glutathione Sepharose等柱料吸附纯化。pGEX载体带有一个tac启动子，可作诱导表达用，适用于任何大肠杆菌，并且可以用温和的洗脱条件从亲和介质上洗脱下来，最大限度地减少对抗原性的活性损伤。

本研究为进一步了解CBX2-1蛋白各结构域的功能提供了分子生物学的基础，并为进一步探索CBX2-1相互作用的蛋白及其与肿瘤发生发展的关系提供了新思路。

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江苏省高校自然科学基金资助项目，编号：13KJD180003。

刘婷隽(1990～)女，江苏徐州人，硕士，助理实验师。

胡安康(1981～)男，江苏徐州人，博士，高级实验师。E-mail：5501908@qq.com。

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1008-0104(2017)03-0118-03

2017-03-16)