Lgr5表达及Kras突变与结直肠癌临床病理特征的相关性研究

程 雪 史 炯 陈洁宇 余慧萍 樊祥山



·基础研究·

Lgr5表达及Kras突变与结直肠癌临床病理特征的相关性研究

程 雪 史 炯 陈洁宇 余慧萍 樊祥山

目的 探讨Lgr5表达及Kras基因突变与结直肠癌临床病理特征的关系。方法 采用免疫组织化学方法，检测539例结直肠癌患者癌组织中Lgr5的表达，应用聚合酶连反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增DNA直接测序法检测Kras基因第12、13密码子突变，并分析其与临床病理特征的关系。结果 在539例结直肠癌中，Lgr5总体表达率为66.79%(360/539)，在不同组织学类型、分化程度及病理分期分组中,其表达差异有统计学意义(P<0.05)，与肿瘤分化(γ=0.102，P=0.018)、肿瘤分期(γ=0.093，P=0.030)、浸润深度(γ=0.131，P=0.002)及是否有脉管和神经的侵犯(γ=0.087，P=0.044)呈正相关性；Kras基因突变总突变检出率为37.29%(201/539)，Kras基因突变与性别及结肠部位有关(P<0.05)，女性及右半结肠的突变率较高。Lgr5表达与Kras基因突变间无相关性。结论 Lgr5表达与肿瘤的发生发展相关，提示Lgr5可能是治疗的潜在靶点。Kras基因突变在女性及右半结肠癌中检出率较高，突变类型与Lgr5表达无显著相关性。

Lgr5；Kras；结直肠癌

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:871～874)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国最常见的消化道肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第四常见病因[1]。本文回顾性的研究结直肠癌中Lrg5表达情况及其与Kras突变之间的关系，进一步分析Lrg5在不同临床病理特征病变中的差别，为结直肠癌预后预测寻找可能的新靶点。

1 材料与方法

1.1 一般资料

随机选取2014年6月至2016年3月在南京鼓楼医院手术根治性切除的结直肠癌标本539例，其中男性319例，女性220例，年龄15～91岁(63.05±13.35)岁，年龄<60岁198例，≥60岁341例；左半结肠癌180例，右半结肠癌151例，直肠癌208例，患者术前均未行放、化疗。患者临床病理分期按第七版AJCC结直肠癌TNM分期标准：Ⅰ期66例，Ⅱ期198例，Ⅲ期237例，Ⅳ期38例。T1 14例，T2 73例，T3 391例，T4 61例；肿瘤最大径≤3 cm 113例，3～5 cm 283例，>5 cm 143例；肿瘤组织学类型：腺癌495例，粘液腺癌41例，印戒细胞癌3例；细胞分化程度：高分化7例，中分化380例，低分化152例；脉管内见癌栓164例，神经见癌组织侵犯233例，其中123例脉管及神经组织同时见癌组织侵犯；无淋巴结转移270例，有淋巴结转移269例；无远处转移501例，有远处转移38例。所有病例均经两位专科病理医师复阅确诊。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗人Lgr5/GPR49单克隆抗体为美国abcam公司产品，抗体稀释度为1∶150。二抗试剂盒是鼠兔通用型二抗，为DAKO公司产品。BenchMark GK全自动免疫组化染色仪购自Roche公司。样本基因组DNA的提取试剂盒OMEGA FFPE DNA Kit为OMEGA公司产品。测序PCR反应使用的BigDye V 3.1仪器购自ABI公司，引物设计、测序依试剂盒说明进行。

1.3 免疫组织化学

标本均经10%中性福尔马林固定，脱水，常规石蜡包埋，5 μm厚切片。连续切片分别用于HE染色，Lgr5免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision法，操作步骤严格按照仪器操作说明书进行。DAB显色，苏木精复染，镜下观察。Lgr5阳性着色部位定位于细胞膜/质。免疫组织化学评分：400×高倍显微镜下随机选择5个视野，对免疫组织化学标记定位准确的阳性细胞进行计数并计算阳性细胞率：胞质、阳性细胞率≤25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，≥75%为4分；染色强度为1，2，3分；最后计算乘积。免疫组织化学评分：0分记“-”为阴性，1～12分记“+”为阳性。

1.4 Kras基因检测

选取肿瘤细胞丰富的蜡块，切2 μm切片一张进行HE染色用于划定肿瘤细胞丰富区域；切取5 μm切片10张，经烤片、脱蜡、水化处理，按照HE切片所划定的区域，刮取选定的肿瘤细胞。对样本基因组DNA进行提取，目的DNA片段的PCR扩增和纯化，测序片段的PCR扩增和纯化，目的片段碱基序列的检测，对结果进行判读。

1.5 统计学方法

应用SPSS 11.0软件进行统计分析，组间比较采用卡方检验分析，P<0.05认为差异有统计学意义。相关性研究使用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 Lgr5表达与结直肠癌临床病理特征的关系

结直肠癌中Lgr5总体表达率为66.79%(360/539)，Lgr5表达与组织学类型、分化程度及病理分期显著相关(P<0.05)，与其他临床病理特征无关。见表1。

表1 Lgr5蛋白表达与结直肠癌临床病理特点的关系(例，%)

2.2 Kras基因第12、13密码子的突变

539例结直肠癌患者中201例患者Kras基因总突变检出率为37.29%(201/539)，第12密码子突变169例，突变检出率31.35%(169/539)，第13密码子突变32例，突变检出率5.94%(32/539)。不同病理特征结直肠癌Kras基因突变情况，见表2。

由表2和表3可知，539例结直肠癌中Kras基因突变与患者性别及结肠癌部位相关(P<0.05)，女性及右半结肠的突变率较高。

表2 539例结直肠癌Kras基因突变情况的比较/例

表3 331例左右结肠癌中Lgr5表达和Kras基因突变情况比较(例，%)

2.3 Lgr5表达与Kras基因突变的相关性

由表4可知，Lgr5表达与Kras基因突变无相关性。Spearman相关性分析显示：Lgr5表达与肿瘤分化(γ=0.102，P=0.018)、肿瘤分期(γ=0.093，P=0.030)、肿瘤浸润深度(γ=0.131，P=0.002)及是否有脉管和神经的侵犯(γ=0.087，P=0.044)呈正相关。肿瘤分化程度与肿瘤大小(γ=0.123，P<0.001)、是否有脉管和神经的侵犯(γ=0.172，P<0.001)，肿瘤分期(γ=0.237，P<0.001)、肿瘤浸润深度(γ=0.213，P<0.001)、肿瘤淋巴结转移情况(γ=0.289，P<0.001)及肿瘤远处转移(γ=0.088，P=0.040)均呈正相关。脉管和神经是否有侵犯与肿瘤分期(γ=0.375，P<0.001)、浸润深度(γ=0.330，P<0.001)、淋巴结转移情况(γ=0.334，P<0.001)及肿瘤远处转移(γ=0.169，P<0.001)呈正相关。肿瘤组织学非腺癌组与腺癌组比较，肿瘤分化程度较差(γ=0.418，P<0.001)、肿瘤较大(γ=0.166，P<0.001)及肿瘤浸润深度较深(γ=0.156，P<0.001)。

表4 Lgr5表达与Kras基因突变的相关性/例

3 讨论

结直肠癌是大肠黏膜上皮发生的恶性肿瘤，是消化系统常见的恶性肿瘤之一[2]，但目前结直肠癌的发病机制尚未完全阐明。

Lgr5广泛分布于人体组织中，在大脑、脊髓、毛囊、乳腺、眼睛、胃肠道、肝脏、胰腺及生殖器官等均有表达[3]，并且在CRC中阳性表达率较癌旁正常组织中显著增高[4-5]。在本研究中，Lgr5在CRC中的总体表达率为66.79%，并且与肿瘤的分化、肿瘤的分期、肿瘤的浸润深度及是否有脉管和神经的侵犯呈正相关。这说明Lgr5与肿瘤的发生进展有关，也提示Lgr5可能是治疗的潜在靶点。另外，也有研究小组研究提示Lgr5过表达参与CRC的出芽侵袭和转移过程[6]。Lgr5是CRC干细胞的标记物，在正常黏膜中也可见少量表达，但本研究未对正常组织和转移灶中的Lgr5的表达进行评估，所以没有观测到其在正常组织及侵袭和转移中的表达。CRC患者中约有20%～45%存在Kras基因突变[7]。本研究中CRC患者Kras总突变检出率37.29%，与其他研究结果基本一致。并且发现Kras基因突变与性别和发生部位相关，多见于女性及右半结肠。Lgr5在CRC的的阳性表达率[4-5,9-10]以及Kras基因的突变[8，10]与不同临床病理特征中的相关性在各个学者的研究中不尽相同。这可能与标本的处理方法、选取的抗体的克隆号和基因测序的仪器、检测的基因片段、实验使用的方法、结果判读的标准以及选取的标本来源地区的不同有关。

另外，肿瘤组织学类型中其他类型分组与腺癌组比较，具有肿瘤分化程度较差，大小较大及浸润深度较深的特点。同时肿瘤分化越差，肿瘤越大，分期越差，浸润越深，越容易脉管、神经侵犯和淋巴结转移。

根据本研究，我们可以看出，Lgr5的表达与结直肠癌临床病理之间存在一定的相关性，特别是与肿瘤的发生发展有关，提示Lgr5可能是治疗的潜在靶点，但是本研究未能阐明Lgr5表达与结直肠肿瘤干细胞之间的关系以及分子机制，并且对于Kras基因突变的研究只针对第12和第13密码子，并不全面。Lgr5以及Kras基因突变在不同临床病理特征中表达期待进一步研究，为分子靶向治疗提供更准确的依据。

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(编辑：吴小红)

Correlation of Lgr5 Expression and Kras Gene Mutations with Clinicopathological Features of Colorectal Cancer

CHENGXue,SHIJiong,CHENJieyu,etal.

NanjingDrumTowerHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNanjingUniversity,Nanjing,210008

Objective To investigate the correlation of Lgr5 expression and Kras gene mutations with clinicopathological features of colorectal cancer(CRC).Methods The expression of Lgr5 in 539 cases of CRC were detected by immunohistochemistry.Genomic DNA was extracted and mutations of Kras gene (codon 12 and 13) were detected by polymerase chain reaction(PCR).Then to explore their relationship with the clinical pathologic features.Results In 539 cases of CRC,Lgr5 expression rate was 66.79%(360/539).Lgr5 expression had statistical significance in different histological type,differentiation degree and pathalogical staging groups(P<0.05).Lgr5 expression was positively correlated with differentiation degree(γ=0.102,P=0.018),pathalogical staging(γ=0.093,P=0.030),infiltration depth(γ=0.131,P=0.002) and whether a vasculai or nerve involvement (γ=0.087,P=0.044).The total Kras gene mutation detection rate was 37.29%(201/539).Kras gene mutation was related in sex and the site of colon groups.The mutation detection rate of female and the right colon cancer were higher than male and the left colon cancer.There was no correlation between Lgr5 expression and Kras gene mutation.Conclusion Lgr5 expression is related with colorectal carcinoma and may be a potential target for therapy.Kras gene mutation has high detection rate in female and right colon cancer,and has no significant correlation with Lgr5 expression.

Lgr5;Kras;Colorectal cancer

国家自然科学基金青年基金项目(编号：81101815)

210008 南京大学医学院附属南京鼓楼医院(程 雪，史炯，陈洁宇，余慧萍，樊祥山)；210004 南京医科大学附属南京妇幼保健院(程 雪)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.001

R735.3+7

A

1001-5930(2017)06-0871-04

2016-07-19

2016-10-09)