过表达STAT1与CD74CD44促进结肠癌细胞粘附和迁移的相关性

徐瑞敏 陈志康 甘惠玲 陈泽伦



过表达STAT1与CD74CD44促进结肠癌细胞粘附和迁移的相关性

徐瑞敏 陈志康 甘惠玲 陈泽伦

目的 探讨信号转导和转录激活子1(STAT1)与CD74/CD44在结肠癌中异常表达与肿瘤转移的相关性。方法 培养结肠癌细胞株Ls-174-T，待其生长至对数生长期，传至第3代收集肿瘤细胞，各细胞分为3份。1份行RT-PCR、Western blotting方法检测STAT1与CD74/CD44表达情况；1份检测定量粘附细胞数；1份以划痕实验检测细胞迁移能力。统计分析比较STAT1与CD74/CD44在结肠癌细胞中的异常表达情况及与肿瘤迁移和粘附能力的相关性。结果 RT-PCR、Western blotting结肠癌组织中STAT1与CD74/CD44的蛋白及mRNA表达显著高于正常结肠组织，两组相比具有统计学差异(P<0.05)。MTT法检测结果显示，不同作用时间(0、6、12、24、48 h)不同剂量STAT1与CD74/CD44过表达质粒(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)干预后，结肠癌细胞体外粘附能力明显加强，与对照组(0.000 mg/ml各组)相比，差异有统计学意义；Transwell结果显示，不同作用时间(0、6、12、24、48 h)不同剂量STAT1与CD74/CD44过表达质粒(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)干预后，结肠癌细胞体外迁移能力随着时间及剂量的增加而明显加强，与对照组(0.000mg/ml各组)相比，差异有统计学意义。结论 STAT1与CD74/CD44在结肠癌细胞中高表达，从而调节结肠癌细胞粘附和迁移能力的作用，表明STAT1与CD74/CD44在结肠癌发生进展中可能与肿瘤的侵袭和转移密切相关。

转录激活子1(STAT1)；CD74/CD44；结肠癌细胞；细胞粘附；迁移

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1094～1098)

近年来，我国结肠癌的发病率不断的上升，而且有年轻化的趋势，肿瘤呈现局部侵袭性，且极易发生转移。基于STAT1与CD74/CD44的基本功能以及两者对肿瘤发生共促进关系的研究，我们推断STAT1与CD74/CD44亦很可能对结肠癌细胞具备同样的生物学效应，即STAT1与CD74/CD44能够通过其受体调控结肠癌细胞的粘附和迁移，进而影响结肠癌的侵袭和转移[1-2]。本研究为明确STAT1与CD74/CD44对结肠癌细胞粘附和迁移力的影响，以期探讨其在结肠癌形成中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂、细胞

胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，结肠癌细胞Ls-174-T(中国科学院细胞库)，DMEM、胰酶、EDTA(GIBCO公司，美国)TaqMix(东盛生物公司)，培养基(美国GIBCO公司)，MTT试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Transwell 24孔培养板(美国 Corning 公司)，10 cm2培养皿、96孔板(美国 Corning 公司)。STAT1与CD74/CD44过表达质粒(美国 PeProtech 公司)避光4 ℃保存，倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)，超净工作台SCW-HS-840型 (苏州市长春电子仪器厂)，培养箱(Queue systems TM2711美国)，深低温冰箱(SANYO，AltraLow日本)，全能型高性能台式冷冻离心机(Heaeus，BiofugeStratos德国)，蒸汽高压消毒箱(Tuttnauer，2540MK美国)。

1.2 细胞培养与传代[3]

含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基对结肠癌细胞Ls-174-T进行培养，置于37 ℃ 5%CO2的孵箱中。传代时机选择在细胞密度达到70%以上的时候进行，首先对培养基清洗后，细胞消化采用含0.02%EDTA的胰蛋白酶，2～3 min对消化后的细胞加入同体积的含血清培养基终止消化，采用倒置显微镜观察细胞以了解消化情况，对贴壁细胞进行吹打，并通过5 min 10 000 r/min的离心分离，去除上清，对细胞悬液进行计数，之后接种到新的培养瓶当中继续培养有待下一次传代。

1.3 分组及干预方法

待细胞贴壁生长至密度为70%～80%时，在不同作用时间(0、6、12、24、48 h)分别予以不同浓度的STAT1与CD74/CD44过表达质粒(美国 PeProtech 公司)(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)，给药作用结肠癌细胞Ls-174-T。

1.4 RT-PCR(半定量逆转录聚合酶链反应)方法

提取总RNA。取2 μg总RNA行逆转录cDNA，反应体系为20 μl。吸取逆转录产物2 μl，分别加入18 sRNA、以构建好的引物进行PCR反应。反应条件均为95℃预变性5 mins，94 ℃变性30 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，72 ℃7 mins，循环30次。PCR产物溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下进行观察并拍摄电泳图像。以18sRNA作为内参照，进行PCR产物的半定量分析，测量各电泳条带之吸光度积分值(A值)。

1.5 Western blotting方法

取细胞提取100mg总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转膜，加STAT1与CD74/CD44一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1h。ECL光化学法显色，用彩色图像分析系统测定吸光度。

1.6 测定STAT1与CD74/CD44对结肠癌细胞粘附能力的影响[4]

取P3代细胞1×104细胞/孔接种至96孔板中，细胞贴壁后，弃掉原有培养基，分别加入含(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)STAT1与CD74/CD44过表达质粒培养基100 μl进行培养，而设置对照组，只加等量的含胎牛血清培养基，在不同作用时间(0、6、12、24、48 h)，加入20 μL 浓度为5 g/L MTT 试剂，37 ℃孵育4 h，弃掉原有培养基，再加入150 μl DMSO之后，持续振荡混匀10 min，通过490 nm吸光度的酶标仪进行检测，参考OD值以表示粘附细胞的数量，按照以下公式计算，细胞粘附抑制率=(1-加药值/空白值)×100%，实验数据重复3次取平均值。

1.7 STAT1与CD74/CD44对结肠癌细胞体外迁移的影响[5]

取各组P3代结肠癌细胞于种板前1天，12 h无血清饥饿处理，常规消化、离心收集细胞，(含0.2% FBS)低血清DMEM培养液混悬成5×105/ml密度的单细胞悬液。并把Transwell培养池放入24孔培养板中，100 μg/ml STAT1与CD74/CD44过表达质粒培养基100 μl进行培养，下室内加入含10% FBS500 μl的DMEM培养液，上室内加入(约5×104细胞)100 μl细胞悬液，置于37 ℃孵箱，5% CO2环境内。各组分别于培养0、6、12、24、48 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室内细胞，运用4%多聚甲醛固定30 min以后，PBS洗2次，30 min 0.1 %结晶紫染色之后，PBS洗2次，以去掉多余染料，最后显微镜下观察拍照。若在小室内有多余水分需要采用棉签吸掉，用十二烷基硫酸钠(SDS)1% 500 μl 30 min溶解细胞。完全溶解之后，取100 μl的细胞裂解液，再次放入96孔板细胞培养板中，通过570 nm酶标仪测定吸光值以了解细胞体外迁移能力。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 结肠癌细胞Ls-174-T的体外形态学变化

培养24 h后，镜下可见大量圆形、折光性强的有核细胞悬浮在培养基上，换液后可见部分结肠癌细胞已从正常细胞中爬出，贴壁生长，呈长梭形，7天左右细胞长满瓶底，呈旋涡状生长。传至第3代显微镜下可见细胞可见生长旺盛、形态均一，呈旋涡状、梭形生长。通过Giemsa染色后显示胞质丰富，细胞呈梭形，细胞核染成紫红色，染色蓝紫色。

2.2 细胞表面抗原免疫荧光鉴定

P3代细胞表面抗原CD34表达阴性、表面抗原CD44、CD105表达阳性。符合结肠癌细胞Ls-174-T表型特征。

2.3 MTT法测定STAT1与CD74/CD44对结肠癌细胞粘附能力的影响

MTT法检测结果显示，STAT1与CD74/CD44过表达质粒不同浓度干预不同时间后，结肠癌细胞体外粘附能力明显加强，与对照组(0.000 mg/ml)相比，差异有统计学意义，见表1。

表1 MTT法测定STAT1与CD74/CD44对结肠癌细胞粘附能力的影响

注：①为与0.000mg/ml相比，P<0.05。

2.4 STAT1与CD74/CD44对结肠癌细胞体外迁移的影响

Transwell结果显示，经不同浓度STAT1与CD74/CD44过表达质粒干预不同时间后，结肠癌细胞体外迁移能力明显加强，与对照组(0.000 mg/ml)相比，差异有统计学意义，见表2。

表2 STAT1与CD74/CD44对结肠癌细胞体外迁移的影响

注：①为与对照组(0.000 mg/ml)相比，P<0.05。

2.5 两组治疗前后STAT1与CD74/CD44mRNA表达水平比较

RT-PCR检测结果显示：STAT1与CD74/CD44mRNA表达水平观察组显著高于对照组，两组相比具有统计学差异(P<0.05)，见表3。

表3 两组STAT1与CD74/CD44mRNA表达水平比较

注：①为与对照组相比，P<0.05；②为与治疗前比较，P<0.05。

2.6 两组治疗前后STAT1与CD74/CD44蛋白表达水平比较

Western blotting结果显示：STAT1与CD74/CD44蛋白表达水平观察组显著高于对照组，两组相比具有统计学差异(P<0.05)，见表4。

表4 两组STAT1与CD74/CD44蛋白表达水平比较

注：①为与对照组相比，P<0.05；②为与治疗前比较，P<0.05。

3 讨论

结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，位于全世界癌症发病率排行的第三位。多年来其发病率保持逐年上升的趋势。结肠癌的复发和转移，是影响患者治疗效果和预后的首要因素[6]。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用，结肠癌的分子遗传学特性和其复发转移相关的生物学模式逐步被发现和了解。结肠癌的转移和复发是1个多因素作用的复杂过程。虽然广大医学和科研工作者进行了充分且细致的研究，但是目前对于结肠癌的转移和复发，仍然缺乏有效且可靠的方法检测以及预测疾病的转归[7]。对于结肠癌相关的基因表达的研究，不仅可以阐明结肠癌的发生、发展、转移及复发的机制，而且对临床上结肠癌的早期诊断、分子生物学分型、复发及转移的早期检测以及治疗评估有着重要的意义[8-9]，而对于转移复发的结肠癌，发现并阐明其分子表面标志物的表达模式，对复发及转移性结肠癌的靶向分子治疗也具有重要的应用价值[10]。因此寻找生物学靶标对于疾病的诊治至关重要，本研究为探求该病的侵袭机制，寻找靶点基因与疾病的相关性，对该病的治疗和预后判断提供一定的指导价值[11]。

肿瘤的发生发展是1个复杂的过程，肿瘤患者死亡的主要原因则是肿瘤的转移和侵袭作用。而此过程机制非常复杂，可将其概括为三步说，即蛋白降解酶、肿瘤细胞的迁移、肿瘤细胞的粘附作用[12]。细胞适度的粘附和迁移能力是机体生命活动与防御机制所必需的，但是，粘附和迁移能力的增强或改变均是导致肿瘤侵袭以及转移的重要因素。当肿瘤细胞的侵袭及粘附能力发生改变，可与局部微环境脱离并降解局部基质，并在迁移能力也异常的情况下，运动至邻近的组织或穿过基底膜和细胞外基质，到达更远的部位建立继发肿瘤，最终导致肿瘤的转移。体外试验研究表明，肿瘤细胞的迁移速度与其转移能力呈正相关。

信号转导子和转录激活子1(STAT1)是1种重要的核转录因子，在干扰素信号传导通路的研究中被发现[12]。STAT1可以在细胞受到外界信号刺激下激活，并直接入核，激活相应的靶基因的转录。STAT1由750个氨基酸组成，其分子量约为91kDa，可分为6个结构域：N端保守序列，螺旋区、DNA结合域、链接区、SH2结构域及C端转录活性域[3]。其DNA结合域可识别的DNA序列碱基数较短，因此可以激活多个靶基因的表达。已有大量研究证明STAT1参与调控与细胞发生、发展、分化和凋亡相关的功能性基因及细胞因子基因的表达。STAT1在原发性肝细胞癌、肺癌和乳腺癌等恶性肿瘤细胞中均存在异常表达的情况。其下游的信号通路对肿瘤的发生、发展及转移亦起到了重要的作用。STAT1在结肠癌中的表达已有文献报道。然而其在结肠癌细胞中起到的作用尚未完全阐明。

CD74是1类分子表面标志物，是HLA Ⅱ复合物的γ亚基。已有研究证明CD74在乳癌、肝癌及白血病细胞等多种肿瘤细胞表面表达[1]。CD74在免疫细胞中，可以特异性地与细胞因子MIF结合，并在CD44的共刺激下，激活胞内ERK1/2的磷酸化，进而由MAPK通路调控多种转录因子的表达。既往有研究证实，MAPK信号通路是STAT家族多种分子基因表达的调控信号通路；而CD74/CD44共刺激信号可能与STAT1存在循环正反馈的双向调控机制；CD74与STAT1的表达存在一定的相关性。有研究者采用高压液相色谱联合质谱分析的方法，对淋巴结转移的三阴性乳腺癌的中STAT1和CD74的表达进行了初步的分析，提示淋巴结转移的TNBC细胞更倾向于高表达STAT1，并且其表达水平与CD74的表达水平显著相关；转染过表达CD74质粒的三阴性乳腺癌细胞株同时会上调STAT1的表达[13]。但已发现的各类肿瘤细胞当中，STAT1具有能升高细胞周期蛋白D1水平，具有促细胞增殖功能的作用，从而进一步促进肿瘤的侵袭和生长迁移；CD74/CD44还可上调血管内皮生长因子的表达，促进肿瘤血管生成间接刺激肿瘤生长和转移。因此，STAT1与CD74/CD44对肿瘤的发生和发展是多方面多层次影响的，其主要通过自身分泌、相关受体、胞内相关因子等环节影响肿瘤细胞的迁移和粘附以及凋亡和分化能力，进而影响肿瘤的发生发展以及侵袭和转移[14]。但是其具体调控机制及信号传导，尚不清晰。

本研究为探讨结肠癌形成过程中观察STAT1与CD74/CD44的表达情况以及其对结肠癌细胞粘附和体外迁移能力的影响。研究结果显示，RT-PCR、Western blotting分子生物学检测结果显示结肠癌细胞中STAT1与CD74/CD44表达显著高于正常结肠组织细胞；通过STAT1与CD74/CD44过表达质粒预处理细胞后，观察发现不同剂量的STAT1与CD74/CD44过表达质粒对结肠癌细胞迁移和粘附能力具有一定的差异性，剂量越高其细胞迁移和粘附能力越强；同时随着干预事件的延长，结肠癌细胞的迁移和粘附能力也随之增强。推断STAT1与CD74/CD44过表达质粒亦很可能对结肠癌细胞具备同样的生物学效应，即STAT1与CD74/CD44过表达质粒能够通过其受体调控结肠癌细胞的粘附和迁移，进而影响结肠癌的侵袭和转移。

综上所述，浓度和时间是对结肠癌细胞株具有不同的转移和侵袭能力，随着时间和浓度的增加，其迁徙和粘附能力逐渐增强。我们推测，STAT1与CD74/CD44过表达质粒可能通过其促进细胞凋亡和促侵袭的作用对结肠癌的发生发展发挥调控作用。本研究阐明了STAT1与CD74/CD44过表达质粒对结肠癌细胞粘附作用和侵袭作用的分子相关性，但是其主要的发病机制有待于深入的研究，同时通过本研究也为结肠癌的临床诊断和预后判断提供了新的策略方法，确定了STAT1与CD74/CD44与结肠癌的相关性，以此作为抗肿瘤治疗分子靶点，或可为临床治疗结肠癌及结肠癌的转移提供新的、有良好前景的方法。

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(编辑：吴小红)

Overexpression of STAT1 and CD74CD44 to Promote Adhesion and Migration of Colon Cancer Cells

XURuimin,CHENZhikang,GANHuiLing,etal.XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha,410008

Objective To investigate the signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and CD74 / CD44 expression in colon cancer cells with abnormal tumor metastasis.Methods Cultured colon cancer cell line Ls-174-T,let it grow to a logarithmic growth phase,the third passage collected tumor cells,each cell was divided into 3 parts.A line of RT-PCR,Western blotting method was used to detect STAT1 and CD74/CD44 expression;a quantitative detection of adherent cells;a scratch test to detect cell migration.Statistical analysis and comparison of STAT1 and CD74 / CD44 in colon cancer cells and abnormal expression correlated with tumor migration and adhesion ability.Results The expression of STAT1 and CD74 / CD44 protein in colorectal cancer tissues was significantly higher than that in normal colorectal tissues (P<0.05).MTT assay test results showed that different time (0,6,12,24,48 h) and different doses of STAT1 and CD74/CD44 over-expression plasmid (0.000,0.001,0.010,0.060,0.100 mg/ml) intervention colon cancer cells In vitro adhesion significantly strengthened with the control group (0.000 mg/ml in each group),the difference was statistically significant;Transwell results showed that different time (0,6,12,24,48 h) and different doses of STAT1 CD74/CD44 over-expression plasmid (0.000,0.001,0.010,0.060,0.100 mg/ml) after the intervention of colon cancer cells in vitro migration with increasing dose and time and significantly strengthened with the control group (0.000 mg/ml in each group),the difference was statistically significant.Conclusion STAT1 and CD74/CD44 is highly expressed in colon cancer cells,thereby regulating the role of colon cancer cell adhesion and migration,indicating that STAT1 and CD74 / CD44 may be associated with tumor invasion and metastasis in colon cancer progression.

Signal transducer and activator of transcription 1(STAT1);CD74 / CD44;Colon cancer cell;Cell adhesion;Migration

410008 中南大学湘雅医院(徐瑞敏，陈志康)；570000 海南省农垦总医院(徐瑞敏，甘惠玲，陈泽伦)

陈志康

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.016

R735.3+5

A

1001-5930(2017)07-1094-05

2016-08-08

2017-04-10)