超声介导正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴对卵巢癌细胞的抑制作用

罗慕华，司徒冰，廖剑艺，李冰城，陈智毅*

(1.广州医科大学附属第三医院药学部，2.超声医学科，广东 广州 510150)

超声介导正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴对卵巢癌细胞的抑制作用

罗慕华1，司徒冰1，廖剑艺2，李冰城2，陈智毅2*

(1.广州医科大学附属第三医院药学部，2.超声医学科，广东 广州 510150)

目的 评价采用正己酰羧甲基壳聚糖制备相变型载阿霉素(DOX)纳米液滴的体外超声显像效果及抑制卵巢癌细胞生长的作用。方法 将羧甲基壳聚糖与正己酸酐发生酰化反应合成正己酰羧甲基壳聚糖，采用声振乳化法制备正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴，表征其表面形态、粒径、电位；评价其体外超声显像效果，以紫外分光光度计测定药物包封率，采用CCK-8法检测卵巢癌细胞存活率，并进行统计学分析。结果 成功制备正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴，镜下为大小均匀的球状物，平均粒径为(458.33±43.50)nm，包封率为(52.06±10.14)%。纳米液滴可增强超声显影效果。超声联合载药纳米液滴组的卵巢癌细胞存活率[(62.54±3.60)%]低于DOX组[(75.55±7.21)%]、载药纳米液滴组[(76.18±4.94)%]和超声组[(89.90±0.83)%]，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 超声联合正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴可有效抑制卵巢癌细胞生长，在临床诊疗中具有潜在应用价值。

羧甲基壳聚糖；载药纳米液滴；超声检查；造影剂；卵巢肿瘤

由于纳米液滴粒径较小，可穿过肿瘤新生微血管内皮细胞间隙，在超声辐照或加热时可发生相变转化成微泡，因此备受关注。但目前用于纳米液滴制备的材料主要为脂溶性物质(脂质和聚合物等)，需使用有机溶剂进行溶解制备，但纳米液滴易残留有机溶剂，可在机体内蓄积引起毒副作用。正己酰羧甲基壳聚糖是一种天然的高分子材料，易溶于水且安全无毒，研究[1-3]表明正己酰羧甲基壳聚糖具有两亲性结构，可包裹疏水药物(喜树碱、姜黄素、木兰醇)，作为载体递送药物，且价格便宜。本研究旨在制备正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴，探讨其联合超声作用下对卵巢癌细胞的抑制作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂与设备 羧甲基壳聚糖(合肥博美生物技术有限责任公司)、正己酸酐(上海阿拉丁生化科技有限公司)、全氟戊烷(百灵威科技有限公司)、阿霉素(北京华奉联博化学材料有限公司)、CCK-8试剂盒(BB-4202-500T，东仁化学科技公司)、卵巢癌A2780细胞(上海锐赛生物技术有限公司)，NanoZS90马尔文粒度仪(英国马尔文仪器公司)、JY-96-INN型超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)、Philips iU-22型超声诊断仪、H7650透射电镜(Hitachi公司)、ELX808酶标仪(BIOTEK公司)、UV-5500紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)、超声转染仪(广州医科大学附属第三医院超声分子影像学研究室自制，频率1 MHz，声强0.2～3.0 W/cm2)、VERTEX 70红外光谱仪(德国布鲁克公司)、AvanceⅢ 磁共振波谱仪(瑞士Bruker)。

1.2正己酰羧甲基壳聚糖的制备及表征 将0.5 g羧甲基壳聚糖溶于水，搅拌过夜至完全溶解，加入甲醇搅拌30 min，加入0.33 ml正己酸酐反应12 h。反应后溶液用25%乙醇溶液透析24 h，再换用纯水透析24 h，对透析后溶液进行冷冻干燥获得合成物。通过红外光谱仪和磁共振波谱仪分析鉴定合成物。

1.3正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴的制备及表征 将0.5 g正己酰羧甲基壳聚糖溶于水并搅拌，用超声处理使其充分溶解。在该溶液中加入全氟戊烷，进行超声乳化，设置脉冲模式，功率20 W，时间5 min(开3 s，关1 s)。采用马尔文粒度仪检测纳米液滴的粒径和电位，在透射电镜下观察其外观。

1.4纳米液滴体外超声显像实验 分别在斯巴达吸管中注入生理盐水和纳米液滴，放入装有37℃脱气水的水槽。采用Philips iU-22型超声诊断仪(L12-5探头，机械指数0.5)观察纳米液滴成像情况；观察5 mg/ml浓度的纳米液滴谐波模式和B模式超声造影成像。利用Image J软件测定不同浓度(2、5 mg/ml)的纳米液滴中心成像区域的灰度值，并将灰度值分别除以生理盐水的超声显影灰度值获得标准化灰度值。

1.5单纯载体细胞毒性实验 检测10 mg/ml浓度的正己酰羧甲基壳聚糖材料对卵巢癌A2780细胞的毒性作用。用完全培养基对其进行分散设置6个复孔，细胞与其孵育24 h。用CCK-8法检测细胞存活率。将CCK-8溶液对细胞进行染色，在全自动酶标仪上测定450 nm处光密度值(optical density, OD)。计算细胞存活率：细胞存活率=(实验孔OD-调零孔OD)/(对照孔OD-调零孔OD)×100%。

1.6载药纳米液滴的制备 对盐酸阿霉素(DOX)进行去盐酸处理，制备去盐酸阿霉素与正己酰羧甲基壳聚糖的质量比分别为1∶5、1∶10、1∶20的溶液并对其搅拌透析。将全氟戊烷加入溶液，在冰浴条件下进行超声乳化，设置脉冲模式，功率20 W，时间10 min(开3 s，关1 s)，获得乳液并对其离心取上清液，用紫外分光光度计测定游离药物吸光度计算载药量和包封率；包封率=(投药量-游离药量)/投药量×100%，载药量=(投药量-游离药量)/(投药量+载体量)×100%。

1.7载药纳米液滴抑制卵巢癌细胞生长实验 将A2780卵巢癌细胞铺至24孔板，细胞密度为 105个/ml，设置实验分组：DOX组(DOX终浓度8 μg/ml)、载药纳米液滴组(DOX终浓度8 μg/ml)、载药纳米液滴联合超声组(DOX终浓度8 μg/ml)、空白组、单纯超声组。超声参数设置为频率1 MHz，占空比20%，声强1.6 W/cm2，辐照时间1 min。4 h后对各组进行换液，并继续孵育。每组设置3组平行组，实验重复3次。细胞培养24 h后，用CCK-8法检测细胞存活率。

2 结果

2.1正己酰羧甲基壳聚糖合成结果 羧甲基壳聚糖和正己酰羧甲基壳聚糖的红外光谱图见图1，与羧甲基壳聚糖红外光谱图相比，正己酰羧甲基壳聚糖在1 645 cm-1和1 520 cm-1处出现了明显的特征峰，分别对应酰胺的羰基伸缩振动的酰胺I带和酰胺Ⅱ带，在2 960 cm-1和2 870 cm-1处属于己基链上的C—H的伸缩振动，表明正己酸酐与羧甲基壳聚糖发生反应。正己酰羧甲基壳聚糖的磁共振波谱见图2，3.2～4.0 ppm之间的峰为正己酰羧甲基壳聚糖的糖环上氢的化学位移，2.0 ppm为正己酰羧甲基壳聚糖—COCH3上氢的化学位移，0.8～1.9 ppm的质子信号峰为己基的—CH2和—CH3，证实己基链已连接在羧甲基壳聚糖的氨基上。

2.2正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴制备 于透射电镜下正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴呈灰黑色、光滑平整、大小均匀的球状物，而内部的全氟戊烷未被染色，镜下可见白色内核且可清晰看到明显的壳核结构(图3)。

2.3正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴粒径及电位分布图 正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴粒径分布见图4，平均粒径为(205.90±45.31)nm，粒径大小分布较均匀，Zeta电位为(-31.9±6.08)mV(图5)。

2.4正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴体外超声显影实验 纳米液滴在不同浓度(2、5 mg/ml)下体外造影情况见图6。在B型超声模式下生理盐水组内部为无回声，而不同浓度的纳米液滴声像图呈细小点状、均匀强回声，随着浓度升高其回声明显增强，2 mg/ml和5 mg/ml的纳米液滴组标准化灰度值分别为3.88和8.64。载药纳米液滴体外超声造影成像结果显示其在超声谐波模式下和B型模式下可进行成像(图7)。

2.5单纯载体细胞毒性实验 正己酰羧甲基壳聚糖浓度为10 mg/ml时，A2780细胞存活率为(93.91±2.81)%。

2.6载药纳米液滴的制备 以3种不同的药物载体质量比制备的载药纳米液滴，在质量比为1∶5时，载药纳米液滴的载药量[(8.68±1.70)%]和包封率[(52.06±10.14)%]达最大值，平均粒径为(458.33±43.50)nm，因此选用该比例制备的载药纳米液滴进行后续研究。

2.7载药纳米液滴抑制卵巢癌A2780细胞生长情况 载药纳米液滴组存活率为(76.18±4.94)%，超声组存活率为(89.90±0.83)%，超声联合载药纳米液滴组的细胞存活率为(62.54±3.60)%，DOX组的细胞存活率为(75.55±7.21)%，存活率总体比较差异有统计学意义(F=13.12，P<0.05)，超声联合载药纳米液滴组较其余各组细胞存活率低，与各组两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

图1 正己酰羧甲基壳聚糖傅里叶红外光谱图 图2 正己酰羧甲基壳聚糖磁共振波谱图 图3 正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴透射电镜图(×40 000) 图4 正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴粒径分布图 图5 正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴电位分布图

图6 正己酰羧甲基壳聚糖纳米液滴在不同浓度下的超声造影成像图 A.生理盐水; B.纳米液滴浓度为2 mg/ml; C.纳米液滴浓度5 mg/ml 图7 载药纳米液滴 (5 mg/ml)超声造影成像图 A.谐波模式成像图; B.B型模式成像图

3 讨论

微泡粒径一般为2～8 μm，不易穿过肿瘤新生微血管内皮细胞间隙(380～750 nm)[4]，因此以微泡作为载体实现药物的有效递送仍存在困难。研究[5]发现液态氟碳纳米液滴粒径为纳米级，因此可穿过肿瘤内皮细胞间隙到达肿瘤细胞，同时能逃逸巨噬细胞的吞噬及肝、脾等脏器的清除，在体内滞留时间较长。本研究根据制备材料的特点对其制备工艺进行优化，制备出粒径为(458.33±43.50)nm的载药纳米液滴。由于纳米液滴进行透射前需染色，导致纳米液滴不稳定，因此在透射电镜观察到的结果较粒度仪检测的粒径分布结果要宽。

目前制备纳米液滴的常见材料有脂质和高分子聚合物。Lin等[6]利用脂质制备载阿霉素纳米液滴，体外实验表明超声可控制纳米液滴中的药物释放并能抑制宫颈癌Hela细胞生长。Mohan等[7]以高分子聚合物制备载阿霉素纳米液滴，分析其在超声辐照下细胞对药物的吸收情况，证明该法可促进药物递送至卵巢癌细胞。Ho等[8]研究超声联合纳米液滴对肿瘤的治疗作用，发现其可破坏肿瘤血管，提高肿瘤治疗效果。

因脂质和高分子聚合物均为脂溶性物质，制备时需使用有机溶剂对其进行溶解，残留的有机溶剂易在生物体内蓄积产生毒性，因此上述以脂质和高分子聚合物制备的纳米液滴存在安全风险。正己酰羧甲基壳聚糖是一种水溶性物质，溶解时不需使用有机溶剂，无生物毒性。另外，它是壳聚糖衍生物的一种，具有良好的生物相容性，可包裹疏水性物质，同时有研究[9-10]证明该材料可作为载体用于药物递送。因此本研究利用正己酰羧甲基壳聚糖制备载药纳米液滴。

本研究比较不同浓度的纳米液滴超声成像情况，参考黄超凡等[11]的方法，对成像图进行定量分析，结果发现纳米液滴浓度越高其灰度值越大，成像效果越明显；同时其细胞毒性实验证实该材料毒性低。因此其可应用于超声成像。

本研究通过分析不同药物载体质量比对纳米液滴理化性质的影响，发现药物载体质量比为1∶5时，可获得较高包封率的载药纳米液滴。虽然随着药物与载体质量比的增加其药物包封率增加，但纳米液滴的粒径也随之变大同时其稳定性随之下降，因此采用该比例进行后续实验。

本研究利用CCK-8法检测各组卵巢癌A2780细胞的存活率，结果显示超声联合载药纳米液滴组的卵巢癌细胞存活率比单纯药物组和载药纳米液滴组的存活率低。Mohan等[7]利用聚合物制备载药纳米液滴，发现相变后的纳米液滴可产生空化效应，在超声作用下膜的通透性增强可促进药物转运，提高治疗效果。此外，借助声孔效应可促进药物胞内运输[12-13]。因此本研究超声联合载药纳米液滴组对卵巢癌细胞抑制作用比载药纳米液滴组和单纯药物组强，提示该方法可抑制卵巢癌细胞生长。

综上所述，本研究成功制备正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴，可进行超声成像，且超声联合该载药纳米液滴可有效抑制卵巢癌细胞生长，因此该载药纳米液滴在肿瘤诊疗方面具有潜在的应用价值。

[1] Huang WT, Larsson M, Wang YJ, et al. Demethoxycurcumin-carrying chitosan-antibody core-shell nanoparticles with multitherapeutic efficacy toward malignant A549 lung tumor: From in vitro characterization to in vivo evaluation. Mol Pharm, 2015,12(4):1242-1249.

[2] Hsiao MH, Tung TH, Hsiao CS, et al. Nano-hybrid carboxymethyl-hexanoyl chitosan modified with (3-aminopropyl) triethoxysilane for camptothecin delivery. Carbohydr Polym, 2012,89(2):632-639.

[3] Wang YJ, Chien YC, Wu CH, et al. Magnolol-loaded core shell hydrogel nanoparticles: Drug release, intracellular uptake, and controlled cytotoxicity for the inhibition of migration of vascular smooth muscle cells. Mol Pharm, 2011,8(6):2339-2349.

[4] Hobbs SK, Monsky WL, Yuan F, et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95:4607-4612.

[5] 周頔,孙阳,王志刚.包裹液态氟碳的多功能纳米粒研究进展.中国医学影像技术,2016,32(1):138-141.

[6] Lin CY, Javadi M, Belnap DM，et al. Ultrasound sensitive eliposomes containing doxorubicin for drug targeting therapy. Nanomedicine, 2014,10(1):67-76.

[7] Mohan P, Rapoport N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: Effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Mol Pharm, 2010,7(6):1959-1973.

[8] Ho YJ, Chang YC, Yeh CK. Improving nanoparticle penetration in tumors by vascular disruption with acoustic droplet vaporization. Theranostics, 2016,6(3):392-403.

[9] Liu KH, Chen BR, Chen SY, et al. Self-assembly behavior and doxorubicin-loading capacity of acylated carboxymethyl chitosans. J Phys Chem B, 2009,113(35):11800-11807.

[10] Yang PS, Tung FI, Chen HP, et al. A novel bubble-forming material for preparing hydrophobic-agent-loaded bubbles with theranostic functionality. Acta Biomater, 2014,10(8):3762-3774.

[11] 黄超凡,曲冠雄,魏振华,等.纳米尺度超声显影微囊的制备及性能表征.高等学校化学学报,2014,35(1):191-198

[12] 刘建新，尚婷婷，徐芬芬，等. 叶酸靶向液态氟碳脂质纳米粒的制备及其超声分子显像卵巢癌实验. 中国医学影像技术，2016，32(12)：1843-1847.

[13] 李庆,赵峰,张佳,等.载多西紫杉醇的新型超声微泡的制备及性能观察.中国介入影像与治疗学,2014,11(7):458-461.

Inhibitory effect of ultrasound-mediated drug loaded carboxymethyl hexanoyl chitosan nanodroplet on ovarian cancer cells

LUOMuhua1,SITUBing1,LIAOJianyi2,LIBingcheng2,CHENZhiyi2*

(1.DepartmentofPharmacy, 2.DepartmentofMedicalUltrasound,theThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China)

Objective To evaluate the inhibitory effect of phase change doxorubicin loaded carboxymethyl hexanoyl chitosan nanodroplet on ovarian cancer cells, and the effect of its ultrasound image in vitro. Methods The carboxymethyl hexanoyl chitosan synthesized through the acylationreaction with carboxymethyl chitosan and hexanoic anhydride. The drug loaded carboxymethyl hexanoyl chitosan nanodroplets were prepared by ultrasonic emulsification. The surface morphology, particle diameter and electric potential were characterized. Ultrasound imaging of the nanodroplet was evaluated in vitro. The encapsulation efficiency was determined by ultraviolet spectrophotometry. The survival rate of ovarian cancer cell was detected using CCK-8 reagent. The statistical analysis was performed. Results The drug loaded carboxymethyl hexanoyl chitosan nanodroplet was successfully prepared which showed regular morphology in microscope, the mean diameter of (458.33±43.50)nm. The encapsulation efficiency was (52.06±10.14)%. The nanodroplet could enhance ultrasonic imaging. The survival rate of ultrasound combined with drug loaded nanodroplet group ([62.54±3.60]%) was lower than those of the free drug group ([75.55±7.21]%) and drug loaded nanodroplet group ([76.18±4.94]%), ultrasound group ([89.90±0.83]%;P<0.05). Conclusion Ultrasound-mediated drug loaded nanodroplet can inhibit ovarian cancer cells, and has the potential for application in the clinical diagnosis and treatment.

Carboxymethyl hexanoyl chitosan; Drug loaded nanodroplet; Ultrasonography; Contrast media; Ovarian neoplasms

国家自然科学基金面上项目(81371572)、广东省自然科学基金(2016A030311054)、广州市科信局项目 (201607010201)。

罗慕华(1991—)，女，广东南海人，在读硕士。研究方向：载药微泡制备技术和分子影像药学。E-mail： 601989295@qq.com

陈智毅，广州医科大学附属第三医院超声医学科，510150。E-mail： winchen@vip.126.com

2016-12-19

2017-02-10

R445.1

A

1003-3289(2017)06-0838-05

10.13929/j.1003-3289.201612070