裸鼠胆囊癌皮下移植瘤超声造影定量参数与血管生成及细胞增殖的相关性

苗 燕，张炎晶，刘利平*，陈 娟，赵育芳，鲁 琴

(1.山西医科大学第一医院超声科，山西 太原 030001；2.山西省人民医院超声科，山西 太原 030012)

裸鼠胆囊癌皮下移植瘤超声造影定量参数与血管生成及细胞增殖的相关性

苗 燕1，张炎晶1，刘利平1*，陈 娟1，赵育芳1，鲁 琴2

(1.山西医科大学第一医院超声科，山西 太原 030001；2.山西省人民医院超声科，山西 太原 030012)

目的 探讨裸鼠胆囊癌皮下移植瘤CEUS定量参数与肿瘤血管生成和细胞增殖状态的相关性。方法 建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，测定CEUS定量参数和微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，并进行相关性分析。结果 成功建立移植瘤20个，最终CEUS成功16个。裸鼠胆囊癌皮下移植瘤PI与MVD、PCNA呈正相关(r=0.635、0.514，P=0.008、0.042)，而CEUS各定量参数与VEGF表达均无相关性(P均>0.05)。裸鼠胆囊癌皮下移植瘤MVD与VEGF、PCNA表达呈正相关(r=0.680、0.650，P=0.004、0.006)，VEGF与PCNA呈正相关(r=0.611，P=0.012)。结论 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤PI与MVD、PCNA呈正相关，有助于评估肿瘤的血管生成及细胞增殖状态；MVD、VEGF、PCNA两两之间均呈正相关，表明肿瘤血管生成与细胞增殖之间相互促进，共同促进肿瘤生长。

胆囊肿瘤；超声检查；造影剂；微血管密度；血管内皮生长因子；增殖细胞核抗原

原发性胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤[1]，恶性程度高，发病率呈上升趋势，且早期诊断困难，预后极差，5年生存率仅5%左右[2]。CEUS可实时显示造影剂微泡在胆囊癌组织微血管内的动态分布，观察病灶的血流灌注特征及供血血管的走行等[3-4]，可有效提高胆囊癌的诊断效能[5-6]。本研究通过建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，探讨CEUS在评价裸鼠胆囊癌血流灌注、血管生成和细胞增殖状态中的应用价值。

1 材料与方法

1.1动物模型制备 正常健康BALB/C裸鼠12只，雄性，3～4周龄，体质量16～18 g(购自常州卡文斯实验动物有限公司)，饲养于山西医科大学动物实验中心(无特定病原体饲养室)。GBC-SD人胆囊癌细胞(购自中国科学院细胞库，细胞株从1名61岁的男性低分化胆囊癌患者中建立)。

随机选取2只裸鼠作为荷瘤鼠，于裸鼠右侧肩胛区皮下接种0.2 ml浓度为1×107/ml的GBC-SD细胞悬液，以结节直径达5 mm×5 mm为成瘤标准。待瘤体长径约1 cm后，用10%水合氯醛经腹腔注射麻醉，钝性剥离瘤体，选取肿瘤边缘有活力的瘤体，用眼科剪将其剪碎为体积约1 mm3的瘤块，放于盛有生理盐水的治疗碗中清洗备用。

取10只裸鼠同上法麻醉后消毒裸鼠双侧肩胛区皮肤，剪开长约2～4 mm的切口，随机夹取2～3块已备好的瘤块，塞入切口周围皮下，缝合、消毒。连续3天对裸鼠后腿部进行青霉素肌肉注射，防止术后感染，3天后拆线。21天后成功建模。

1.2仪器与方法 采用GE Logiq E9型彩色超声诊断仪，ML6-15宽频探头，频率15 MHz，机械指数0.09，造影剂为SonoVue。造影过程中显像深度、声压和增益等设置均保持不变。将裸鼠麻醉后侧卧位保定于检查床。先常规超声观察并选择肿瘤的最大切面，测量肿瘤长径(L)和前后径(W)，依据公式计算体积：体积=长径×前后径2/2。再按预设造影条件进入造影模式，消毒裸鼠尾静脉，快速推注SonoVue混悬液0.1 ml[7]，即刻计时，动态观察并存储图像。可顺利完成造影剂的推注且移植瘤显影即视为CEUS成功。

1.3图像分析 采用TIC-Analysis定量分析软件，避开肿瘤中央坏死区及较粗大血管，于肿瘤周边强化区内勾画相同大小ROI(2 mm×2 mm)，获得定量参数：到达时间(arrival time, AT)、达峰时间(time to peak, TTP)、峰值强度(peak intensity, PI)、曲线下面积(area under curve, AUC)1(AT到TTP内的AUC)、AUC 2(AT到其后1 min内的AUC)，由2名有经验的超声诊断医师进行CEUS检查及分析，并达成一致意见。

1.4免疫组化染色与结果判定 CEUS后处死裸鼠，及时剥离肿瘤，在福尔马林溶液中固定、脱水、透明，石蜡包埋、切片，行HE染色及免疫组化染色。

免疫组化中的一抗为抗CD34多克隆抗体、抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗体和抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体(均购自北京中杉金桥生物工程公司)。按照试剂说明书进行免疫组化染色，参照文献[8]判断肿瘤微血管密度(microvessel density, MVD)：先于100倍镜下寻找3个血管密集区(即“热点”)，再于250倍镜下计数棕染的内皮细胞或细胞簇的数目，不论微血管管腔形成与否均视为1个微血管计数，其均值为该切片的MVD。VEGF表达水平的判断：先于100倍镜下寻找3个胞浆和胞膜棕染的阳性细胞密集区，再转至250倍镜下，根据染色范围(阴性为0分；阳性细胞 1%～25%为1分；阳性细胞26%～50%为2分；阳性细胞51%～75%为3分；阳性细胞76%～100%为4分)和染色强度(0分：阴性；1分：弱阳性；2分：阳性；3分：强阳性)进行评分，两者得分相加记为单个视野的总分，测3个视野取平均值[9]。PCNA表达水平的判断：以细胞核棕染视为阳性表达；评分方法与VEGF相同[10]。

表1 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤CEUS定量参数与MVD、VEGF、 PCNA的相关性分析结果

图1 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤CEUS表现 A.瘤体剖面图，瘤体苍白、质韧； B.增强早期(2 s)瘤体呈快速环形增强(箭)； C.达峰时(6 s)瘤体整体明显均匀增强(箭)； D.增强晚期瘤体逐渐廓清(箭)

2 结果

成功建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤20个，其中2只(4个移植瘤)因经尾静脉推注SonoVue混悬液不成功，次日死亡，最终CEUS成功的移植瘤共16个。常规超声测量肿瘤平均长径(0.92±0.27)cm，前后径(0.67±0.18)cm，体积(0.25±0.22)cm3，呈均匀或不均匀低回声，圆形或椭圆形，外生性和膨胀性生长，边界尚清。

2.1CEUS表现 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤CEUS早期呈快速环形增强，其中5个移植瘤达峰值时整体呈均匀增强(图1)，11个移植瘤中央伴不规则状持续无增强区，增强晚期肿瘤内造影剂逐渐廓清。

2.2病理表现 瘤体大体标本苍白、质韧(图1A)，部分瘤体中央呈乳糜样坏死。镜下观察：HE染色示肿瘤细胞排列杂乱，内有大量分化程度低、形状不规则、大小不一、胞质丰富的深染巨核细胞，细胞核异型性明显，同时可见少量核分裂象及多核瘤巨细胞(图2)。

2.3相关性分析 16个移植CEUS定量参数AT、TTP、PI、AUC1、AUC2分别为(0.40±0.29)s、(6.37±3.51)s、(16.75±5.82)dB、52.88±29.83、582.93±335.60，MVD计数为13.09±3.45；VEGF蛋白表达为4.75±0.46；PCNA蛋白表达为4.75±1.44。PI与MVD、PCNA呈正相关(r=0.635、0.514，P=0.008、0.042)，CEUS各定量参数与VEGF均无相关性，见表1。MVD与VEGF、PCNA表达呈正相关(r=0.680、0.650，P=0.004、0.006)，VEGF与PCNA表达呈正相关(r=0.611，P=0.012)。

3 讨论

CEUS因具有实时、动态、可重复检查，以及无创、无辐射、过敏反应少等优点，已成为近年来迅速发展的影像学方法之一[11-12]。超声造影剂SonoVue微泡直径与红细胞相当，不会溢出血管外进入组织间隙，被称为纯血池显像剂，可更好地反映肿瘤内部及周边的血流灌注及血管生成情况[13]。

恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后与肿瘤血管生成密不可分。CEUS与时间信号曲线定量参数相结合，可很好地反映肿瘤血管生成及血供分布情况，提高病灶血管检出的敏感度[14]。MVD是肿瘤血管生成研究中的重要指标之一。本研究结果显示，裸鼠胆囊癌皮下移植瘤CEUS早期呈迅速高增强，且CEUS的PI与MVD呈正相关，提示裸鼠胆囊癌皮下移植瘤属血管依赖性肿瘤，其内新生血管网非常丰富，CEUS可间接提示胆囊癌MVD的表达水平，有助于评估肿瘤血管的生成。

VEGF是一个选择性促内皮细胞有丝分裂素，属胱氨酸生长因子超家族，是目前已知的作用最强、特异性最高的血管生成促进因子之一。本研究显示裸鼠胆囊癌皮下移植瘤MVD与VEGF的表达存在正相关 (r=0.680，P=0.004)，可间接反映VEGF有促进新生血管形成的作用。但裸鼠胆囊癌皮下移植瘤CEUS各定量参数与VEGF的表达均无相关性，与既往报道[15]一致，可能由于肿瘤血管生成有赖于周围环境，VEGF虽是最强有力的血管生成促进因子，但其血管生成是由多种因子共同作用的结果。

图2 裸鼠胆囊癌皮下移植瘤病理图(×250) A.HE染色示肿瘤中央细胞异型性明显，排列紊乱，细胞核大深染，分裂象多见； B.CD34染色示血管内皮细胞呈棕黄色； C.VEGF染色示胞浆或胞膜棕染； D.PCNA染色示细胞核棕染

PCNA是细胞核内合成的一种酸性蛋白质，促进细胞周期中的DNA复制，是评价细胞增殖状态的可靠指标之一，同时与肿瘤的分化、侵袭、转移、预后和复发等均有显著相关性[16]。本研究显示裸鼠胆囊癌皮下移植瘤PI与PCNA呈正相关，有助于评估肿瘤的细胞增殖状态。另外本研究中MVD、VEGF均与PCNA呈正相关，提示裸鼠胆囊癌皮下移植瘤细胞的增殖状态与肿瘤组织表达VEGF进而促进新生血管形成密切相关。

本研究AT、TTP、AUC1、AUC2定量参数分别与MVD、VEGF及PCNA不存在相关性，原因可能为：①样本量较小，AT、TTP、AUC1、AUC2分别表示病灶开始增强的时间、病灶增强强度达高峰的时间及病灶特定时间范围内的平均血流灌注量，与MVD、VEGF及PCNA间的关系不明显；②部分裸鼠麻醉过浅，CEUS中动物的晃动会使肿瘤ROI发生偏移，特别是在肿瘤体积小或内部坏死区域较多时，CEUS各定量参数的测值可能受影响。

总之，本研究中MVD、VEGF、PCNA间均存在正相关关系，表明肿瘤血管生成与细胞增殖之间相互促进，共同有利于肿瘤的生长发展；裸鼠胆囊癌皮下移植瘤CEUS的PI值可间接反映肿瘤MVD、PCNA的丰富程度，CEUS定量技术在评价裸鼠胆囊癌血管生成及细胞增殖状态中具有一定的应用价值。

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Correlation between CEUS parameters and angiogenesis and cell proliferation of gallbladder carcinoma transplant tumor in nude mice

MIAOYan1,ZHANGYanjing1,LIULiping1*,CHENJuan1,ZHAOYufang1,LUQin2

(1.DepartmentofUltrasound,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2.DepartmentofUltrasound,ShanxiProvincialPeoples'sHospital,Taiyuan030012,China)

Objective To explore the correlation between CEUS blood perfusion characteristics and angiogenesis and cell proliferation in nude mice models of gallbladder carcinoma transplant tumor. Methods Nude mice models of gallbladder carcinoma transplant tumor were established. The blood perfusion characteristics of the nude mice models were quantitatively analyzed, CEUS quantitative parameters and the expression levels of microvessel density (MVD), vascular endothelial growth factor (VEGF) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemically were obtained. The correlations were performed. Results Twenty tumors were successfully established. The CEUS of 16 tumors was successful. There was positive correlation between peak intensity (PI) and MVD, PCNA (r=0.635, 0.514,P=0.008, 0.042). The CEUS parameters were not correlated with expression of VEGF. MVD had positive correlation with expression of VEGF, PCNA (r=0.680, 0.650,P=0.004, 0.006); VEGF had positive correlation with expression of PCNA (r=0.611,P=0.012). Conclusion The PI of CEUS is positive correlation with MVD and PCNA in nude mice models of gallbladder carcinoma transplant tumor, which may be helpful to evaluate tumor angiogenesis and cell proliferation state. The MVD, VEGF and PCNA positively correlates to each other, which indicates there is the relationship of reciprocal promotion between tumor angiogenesis and cell proliferation, and is good for tumor growth.

Gallbladder neoplasms; Ultrasonography; Contrast media; Microvessel density; Vascular endothelial growth factor; Proliferating cell nuclear antigen

山西省自然科学基金面上项目(2014011037-4)、山西省人力资源和社会保障厅留学回国人员择优资助项目(晋人社厅2014-95)、山西医科大学第一医院院级医技基金项目(YJ1406)。

苗燕(1990—)，女，山西武乡人，硕士，医师。研究方向：胆囊癌的超声诊断。E-mail: 287614535@qq.com

刘利平，山西医科大学第一医院超声科，030001。E-mail: liuliping1600@sina.com

2016-10-13

2017-04-16

R-332; R445.1

A

1003-3289(2017)06-0822-04

10.13929/j.1003-3289.201610049