基于指纹图谱及多指标成分定量的丹参提取工艺对比研究*

谢兴亮，薛棱芬，殷雅卓，李 敏，盛艳梅

成都医学院 药学院(成都 610500)

·论著·

基于指纹图谱及多指标成分定量的丹参提取工艺对比研究*

谢兴亮，薛棱芬，殷雅卓，李 敏，盛艳梅△

成都医学院 药学院(成都 610500)

目的 对已上市制剂中丹参不同提取工艺的提取效果进行对比分析。方法 按照冠心丹参胶囊、复方丹参片、复方丹参滴丸、丹参片4种代表制剂的提取工艺制备丹参提取液，研究建立同时测定提取液指纹图谱及多指标含量的HPLC方法，测定不同丹参提取液的丹参素钠、丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量及指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算指纹图谱的相似度。结果 4种丹参提取液中丹参酮ⅡA、丹参素钠、丹酚酸B含量分别为0.27～1.25、1.44～4.46、33.77～93.92 mg·g-1；冠心丹参胶囊与丹参片、复方丹参滴丸、复方丹参片的指纹图谱相似度分别为0.781、0.853、0.758，复方丹参滴丸与复方丹参片的指纹图谱相似度为0.879。结论 4种代表制剂丹参提取工艺的丹参酮ⅡA、丹参素钠、丹酚酸B含量及指纹图谱均存在明显差异，针对相同的临床适应症，需深入研究以实现丹参工艺的标准化、规范化。

丹参；提取工艺；指标成分；指纹图谱；

丹参为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈的功效[1]。随着研究的深入，丹参的药效物质基础及作用机理已阐释的较为清楚，其中酚酸类和醌类成分为治疗心血管系统疾病的药效成分，水溶性酚酸类成分主要作用为抗动脉粥样硬化、保护心肌细胞和血管内皮等[2-4]；脂溶性丹参酮类成分则主要是改善心脏功能，具有抗缺血性心律失常、抗缺血缺氧和抑制心肌细胞凋亡、抑制心肌肥大、抑制心肌纤维化、减少心肌梗死面积等多种作用[5-9]。

目前，含有丹参的中成药品种多达300余种[10]，其中中国药典2015年版收录的用于治疗冠心病心绞痛所致胸闷、刺痛等心血管系统疾病的品种有复方丹参片(丸、胶囊、喷雾剂、颗粒)、冠心丹参胶囊(片)、复方丹参滴丸、丹参片等[1]，其功能主治与临床适应症基本相同。然而，对比分析其制法可看出，丹参的提取分别采用了渗漉法、回流法和煎煮法等多种方法；提取溶剂有醇水双提和单用水提两类；乙醇浓度有95%、90%、50% 3种，工艺存在较大差异。基于现有对丹参药效成分的认识，这些提取工艺的差异有可能导致药效成分提取效果的不同，值得深入对比研究。本研究对4种制剂的丹参提取液中丹参酮ⅡA、丹参素钠、丹酚酸B等药效成分的含量和指纹图谱相似度进行对比分析，以深入了解各提取工艺的提取效果及其差异，为研究改进丹参类制剂的提取工艺提供实验依据，促进丹参制剂质量内涵的不断提升。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Ultimate3000型高效液相色谱仪(美国戴安)；BP211D型分析天平(德国Sartorius)；UPH-1-20T型优谱超纯水仪(成都超纯科技有限公司)；ZDHW电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；S10P型超声波清洗机(美国致微仪器有限公司)；HH-2水浴锅(上海常思工贸有限公司)；SHZ-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本，国家药典委员会)。

丹参饮片(购于泸州百草堂中药饮片有限公司，经鉴定为唇形科植物丹参S.miltiorrhigaBge.的干燥根及根茎)；丹参素钠对照品(99.87%, 成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-15072414)；丹参酮ⅡA对照品(99.08%, 成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-14122512)；丹酚酸B对照品(99.02%，成都曼斯特生物科技有限公司，MUSI-15051708)；色谱纯甲醇(SWELL，7100014000)；色谱纯乙腈(诺尔施公司，2015112301)；水为纯化水；无水磷酸(成都市科龙化工试剂厂，2014062401)；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 丹参提取液的制备 1)取丹参粉碎成中粉，称取100 g，加90%乙醇作溶剂进行渗漉，流速为0.15 mL·min-1，收集渗漉液700 mL，药渣加800 mL水煎煮2次，每次1 h，滤过，合并煎液，加50%乙醇稀释定容至2 400 mL，得冠心丹参胶囊丹参提取液。2)称取100 g丹参饮片，加入800 mL乙醇回流1.5 h，滤过，药渣加800 mL 50%乙醇加热回流1.5 h，滤过，药渣再加800 mL水煎煮2 h，合并提取液，加50%乙醇稀释定容至2 400 mL，得复方丹参片丹参提取液。3)称取丹参饮片100 g，加入800 mL水煎煮1.5 h，滤过，药渣再加800 mL水煎煮1.5 h，滤过，合并2次滤液，加50%乙醇稀释定容至2 400 mL，得复方丹参滴丸丹参提取液。4)称取丹参饮片100 g，加入800 mL 90%乙醇回流1.5 h，滤过，药渣加入800 mL水煎煮1 h，滤过，合并2次滤液，加50%乙醇稀释定容至2 400 mL，得丹参片丹参提取液。

1.2.2 多指标成分的含量测定 1)对照品液配制：分别取丹参酮ⅡA、丹酚酸B、丹参素钠对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀释定容至刻度，配制得浓度依次为10、100、30 μg/mL的混合对照品溶液。2)供试品制备：精密移取复方丹参片的丹参提取液1 mL于25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μM微孔滤膜滤过，即得丹参供试品溶液。3)色谱条件考察：采用高效液相色谱法测定，色谱条件为Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相：乙腈(A)-0.03%磷酸(B)，梯度洗脱(0～9 min：10%A→19%A；9～20 min：19%A→41%A；20～30 min：41%A；30～45 min：41%A→80%A：45～55 min：80%A)，流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃，结果在该条件下丹参供试品液中丹参素钠、丹酚酸B和丹参酮ⅡA 3个指标色谱峰均可实现基线分离，且其他色谱峰也能获得良好分离(图1)。4)线性范围考察：经测定丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA分别在0.004 752～0.047 520 μg，0.112 4～1.124 0 μg，0.022 74～0.227 40 μg范围内线性关系良好。5)精密度考察：6次重复进样测定丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA峰面积的RSD依次为0.79%、0.14%、0.90%，精密度良好。6)稳定性与重复性考察：丹参供试品溶液中丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA在制备后室温下放置24 h内基本稳定(峰面积RSD依次为1.79%、0.77%、1.23%)，重复性(丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA含量的RSD依次为2.72%、1.36%、2.62%)符合要求。7)加样回收率考察：精密移取复方丹参片的丹参提取液0.5 mL于25 mL量瓶中，平行9 份，分别精密加入丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA浓度依次为0.039 8、1.210 0、0.030 5 mg/mL的混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL(每个浓度各3 份)，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μM微孔滤膜滤过，取续滤液按上述色谱条件进样10 μL 进行测定，并计算回收率(表1)，均符合测定要求。

图1 混合对照品(A)和丹参供试品液(B)的高效液相色谱图

指标成分样品中含量/mg加入量/mg平均回收率/%RSD/%0.038330.03184103.60.48丹参素钠0.038330.03980102.60.400.038330.04776102.30.311.144200.96800102.80.73丹酚酸B1.144201.21000102.40.471.144201.45200100.70.310.026040.02440102.60.92丹参酮ⅡA0.026040.03050101.51.220.026040.03660100.601.74

1.2.3 指纹图谱的测定与相似度评价 1)精密度考察：精密吸取“1.2.2”项下供试品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样6 次，记录色谱图和峰面积，以6 次平均值为模板，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度。结果显示，各色谱图的相似度均>0.99，各峰峰面积的RSD均<3%，表明仪器的精密度良好。2)稳定性考察：取复方丹参片的丹参提取液按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样10 μL，记录色谱图和峰面积，以0 h 色谱图为模板同法计算相似度，结果各色谱图相似度均>0.99，各峰峰面积的RSD均<3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。3)重复性考察：取复方丹参片的丹参提取液6份，按“1.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按上述色谱条件，进样10 μL，记录色谱图和峰面积，以6 份平均值为模板同法计算其相似度，结果显示，各色谱图的相似度均>0.99，各峰峰面积的RSD均<3%，表明本方法的重复性良好。

2 结果

2.1 不同提取工艺多指标成分含量的测定结果

取1.2.1项下制备的4种制剂丹参提取液，按照拟定方法配制供试品溶液，在拟定色谱条件下进样测定峰面积，计算提取液中丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA含量(表2)。结果显示，4种丹参提取工艺所得提取液中丹参酮ⅡA、丹参素钠、丹酚酸B及其总含量均存在明显差异，其中丹参素钠以复方丹参滴丸含量最高而丹参片最低，二者相差3.1倍；丹酚酸B以冠心丹参胶囊含量最高而丹参片最低，二者相差2.8倍；丹参酮ⅡA以复方丹参片含量最高而复方丹参滴丸最低，二者相差4.6倍；3种成分的提取总量以冠心丹参胶囊最高而丹参片最低，总量相差达2.7倍。

表2 丹参不同提取工艺的成分含量测定结果

2.2 不同提取工艺指纹图谱相似度的评价结果

取1.2.1项下制备的4种丹参提取液，按照“1.2.2”项下方法制备不同提取工艺的供试品溶液，按上述色谱条件，进样测定得色谱图，将各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本，分别以丹参片、冠心丹参胶囊、复方丹参滴丸的丹参色谱图为模板计算不同提取工艺指纹图谱的相似度(表3、图2)。结果显示，冠心丹参胶囊与丹参片、复方丹参滴丸、复方丹参片的图谱相似度分别为0.781、0.853、0.758，复方丹参滴丸与复方丹参片的相似度为0.879，表明这些制剂中丹参提取液成分组成存在较大差异。

表3 丹参不同提取工艺指纹图谱的相似度评价结果

图2 丹参不同提取工艺提取液的指纹图谱

3 讨论

《中国药典》2015年版一部丹参项下对丹参酮类、丹酚酸B分别进行了含量测定，实现了丹参脂溶性和水溶性两类药效成分的质量控制，但在两种色谱系统下分别测定，操作过程较为繁琐。本研究在参考程沛等[11]拟定的色谱条件基础上，以乙腈-0.03%磷酸溶液系统进行梯度洗脱，并根据丹参提取液的色谱峰分离情况，进行了梯度程序优化，既可同时测定丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的含量，提取液中其他成分色谱峰也获得了良好分离，为后续对比不同提取工艺的指纹图谱相似度奠定了方法学基础。

受历史认知、技术条件等限制，药味相同、工艺不同而临床适应症相同的现象在中成药中并不鲜见，其中丹参类制剂是一典型，据肖禾等[10]统计有生药粉入药、单独水煎煮、混合水煎煮、乙醇单提、乙醇混合提取、乙醇和水提取等多种使用方式，其对物质基础及临床疗效的影响值得深入探讨。郑琴等[12]对不同丹参提取工艺中丹参酮ⅡA、丹酚酸B的含量进行了对比，发现存在较大差异。然而，基于中药多组分整体起效的特点，仅以单体成分为标准所获信息仍嫌不足。本研究以丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的含量和指纹图谱相似度为评价指标，从点、面2个层次对药典中所载4类含丹参制剂不同工艺的提取效果进行了对比。结果发现，药效成分含量和指纹图谱均存在明显差异。其中，丹参素钠在采用水煎煮提取2次的复方丹参滴丸和冠心丹参胶囊中含量较高，丹酚酸B在采用室温渗漉提取的冠心丹参胶囊中含量明显高于其他制剂，而丹参酮ⅡA在采用单独水煎煮提取的复方丹参滴丸中含量明显低于其余3种制剂。指纹图谱相似度评价结果显示，冠心丹参胶囊的整体提取效果与丹参片、复方丹参滴丸、复方丹参片存在明显差异。

总体而言，除冠心丹参胶囊对3种成分的提取相对均衡外，其余3种制剂的提取效果各有偏重，难以实现丹参水溶性和脂溶性类药效成分的兼顾提取，而冠心丹参胶囊中丹参素钠、丹参酮ⅡA的提取效果仍不理想。由于药典标准主要对提取方法、溶剂、次数等关键参数进行了规定，而未明确溶剂用量、提取时间等次要因素。本研究设计时为尽量减少干扰，未明确的参数均统一为相同水平，故实验结果仅供业内学者研究参考，并不能完全代表生产工艺的实际情况，而针对心血管系统类疾病的治疗，要推动丹参提取工艺和药效物质基础的标准化、规范化，最终还需以临床大数据基础上的客观疗效为判断依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部(2015年版)[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]权伟, 周丹, 郭超, 等. 丹参素钠通过抑制炎症反应对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用[J]. 中南药学, 2012, 10(12): 885-888.

[3]汪旻晖, 单娇娇, 李浣钧, 等. 丹参素对异丙肾上腺素损伤大鼠内皮血管活性的保护作用及机制研究[J]. 中草药, 2013, 44(1): 59-64.

[4]张扬, 薛凌. 丹酚酸B对动脉粥样硬化CD40-CD40配体信号通路的影响[J]. 中国医学工程, 2012，20(11):6-7,9.

[5]Zhang Y, Zhang L, Chu W,etal. Tanshinone ⅡA inhibits miR-1 expression through p38 MAPK signal pathway in post-infarction rat cardiomyocytes[J]. Cell Physiol Biochem, 2010, 26(6): 991-998.

[6]Yuan X, Jing S, Wu L,etal. Pharmacological postconditioning with tanshinone ⅡA attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by activating the phosphatidylinositol 3-kinase pathway[J]. Exp Ther Med, 2014, 8(3): 973-977.

[7]Jiang F L, Leo S, Wang X G,etal. Effect of tanshinone ⅡA on cardiomyocyte hypertrophy and apoptosis in spontaneously hypertensive rats[J]. Exp Ther Med, 2013, 6(6): 1517-1521.

[8]Yang F, Li P, Li H,etal. microRNA-29b Mediates the Antifibrotic Effect of Tanshinone ⅡA in Postinfarct Cardiac Remodeling[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2015, 65(5): 456-464.

[9]Hu Q, Wei B, Wei L,etal. Sodium tanshinone ⅡA sulfonate ameliorates ischemia-induced myocardial inflammation and lipid accumulation in Beagle dogs through NLRP3 inflammasome[J]. Int J Cardiol, 2015, 196: 183-192.

[10] 肖禾, 宋民宪, 赖娟. 处方相同的丹参制剂的比较分析[J]. 中成药, 2005, 27(8): 953-956.

[11] 程沛, 韩东岐, 胡伟慧, 等. 高效液相色谱法同时测定丹参中10种水溶性和4种脂溶性成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2015，35(6): 991-996.

[12] 郑琴, 胡鹏翼, 杨明, 等. 丹参制剂中丹参不同提取方法的合理性评价[J]. 中国药房, 2011, 22(35): 3293-3295.

A Contrastive Study on the Extraction Methods of Radix Salviae Miltiorrhizae by HPLC Fingerprint and Multi-component Quantitative Analysis

Xie Xingliang, Xue Lingfen, Yin Yazhuo, Li Min, Sheng Yanmei△.

School of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To compare and analyze the extraction effect of different extraction methods of Radix Salvia Miltiorrhiza among the listed preparations. Methods The salvia miltiorrhiza extracts were prepared according to the extraction methods of the four representative preparations including Guanxin Danshen capsules, compound Danshen tablets, compound Danshen dripping pills and Danshen tablets. The HPLC method for simultaneous determination of the fingerprints and the content of the multiple indexes of Salvia miltiorrhiza extracts were established to determine the content of sodium Danshensu, salvianolic acid B and tanshinone ⅡA and the fingerprints of different Salvia miltiorrhiza extracts. The similarity evaluation software of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint was adopted to calculate the similarity degree of fingerprints. Results The contents of sodium Danshensu, salvianolic acid B and tanshinone ⅡA in the four Salvia miltiorrhiza extracts were 0.27～1.25，1.44～4.46，33.77～93.92 and 36.26～97.90 mg·g-1 respectively. The fingerprint similarity of Guanxin Danshen tablets with Danshen tablets, compound Danshen dripping pills and Compound Danshen tablets were 0.781, 0.853 and 0.758 respectively. The fingerprint similarity between compound Danshen dripping pills and compound Danshen tablets was 0.879. Conclusion The fingerprints and the content of sodium Danshensu, salvianolic acid B and tanshinone ⅡA in the Salvia miltiorrhiza extracts of the four representative preparations are obviously different. Further research is needed to realize the standardization and normalization of the process for the same clinical indications.

Radix Salviae Miltiorrhizae; Extraction methods; Index components; HPLC fingerprint

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20170124.0000.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.03.001

国家自然科学基金项目(No：81403311)

R284

A

△通信作者：盛艳梅，E-mail：467131233@qq.com