p27及HIF-1α在二甲双胍调节下咽癌细胞增殖与凋亡中的作用研究

单 珊，李晓明，周晨阳，苗玉花

·基础研究·

p27及HIF-1α在二甲双胍调节下咽癌细胞增殖与凋亡中的作用研究

单 珊，李晓明，周晨阳，苗玉花

目的 探讨二甲双胍在下咽癌细胞增殖与凋亡中的作用，以及p27和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)蛋白在该调节机制中的作用，为临床治疗下咽癌提供进一步的理论基础。方法 以0、5、10 mmol/L二甲双胍干预体外培养人下咽癌Fadu细胞24 h，5 mmol/L组再干预至48 h，应用免疫细胞化学法检测p27和HIF-1α蛋白的表达。下咽癌移植瘤裸鼠随机分为对照组(不予二甲双胍干预)，低剂量二甲双胍治疗组(met 40组，每日40 mg/kg)，高剂量二甲双胍治疗组(met 200组，每日200 mg/kg)，各5只，腹腔注射给药28 d后，取移植瘤测量肿瘤体积，计算抑瘤率； HE染色观察肿瘤细胞形态，免疫组织化学染色法检测p27和HIF-1α蛋白表达水平的变化。结果 体外培养的Fadu细胞p27蛋白表达随二甲双胍干预浓度的增加及干预时间的延长而增加(P均<0.05)，而HIF-1α蛋白表达随二甲双胍干预浓度的增加及干预时间的延长而降低(P均<0.05)。下咽癌移植瘤裸鼠药物干预后，met 40组和met 200组移植瘤体积均较对照组缩小(P均<0.05)；移植瘤标本p27蛋白表达随给药浓度的增加而增加，HIF-1α蛋白表达随给药浓度增加而降低(P均<0.05)。结论 二甲双胍可有效抑制下咽癌细胞体内、体外的增殖并促进其凋亡，为临床治疗下咽癌提供进一步的理论依据。

二甲双胍；下咽肿瘤；Fadu细胞；p27；HIF-1α；细胞增殖；细胞凋亡

自Evans等[1]发现二甲双胍能显著降低糖尿病患者的肿瘤风险后，近十多年开展了大量关于二甲双胍抗肿瘤效应的研究。多项关于乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多种肿瘤类型的体内外实验研究已经证实，二甲双胍确实存在抗肿瘤的生物学特性[2-3]。而且一些研究也已证实二甲双胍具有抑制肿瘤细胞蛋白合成、阻滞细胞周期发展、抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡的功能[4]。但下咽癌相关研究却鲜见报道。p27基因是近年来发现的一个重要的抑癌基因，其编码的p27蛋白为细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子，可负性调控细胞周期[5-9]。另有研究表明，二甲双胍可减少肿瘤细胞氧的消耗，经转录及转录后机制抑制缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)的聚集，使HIF-1α的表达量减少，降低肿瘤的发生率[10]。本实验的目的是通过体内、体外实验，研究p27、HIF-1α在二甲双胍调节下咽癌细胞增殖与凋亡中的作用，为临床治疗下咽癌提供进一步的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与实验动物 Fadu人下咽癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，DMEM培养基购自美国Gibico公司，特级胎牛血清购自以色列BI公司，二甲双胍购自中国药品生物制品鉴定所，兔抗p27多克隆抗体、兔抗HIF-1α多克隆抗体购自中国Affinity公司。雄性4周龄BALB/c Nude SPF小鼠22只，体重19～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK(京)2012-0001，使用许可证号为SYXK(军)2013-0002。

1.2 实验方法

1.2.1 二甲双胍对Fadu细胞p27及HIF-1α蛋白的表达：制备细胞爬片，细胞贴壁生长后，以含0、5、10 mmol/L二甲双胍的培养基(对照组、5 mmol/L组、10 mmol/L组)培养细胞至24 h，5 mmol/L组再干预至48 h，取出玻片应用免疫细胞化学法行SP染色检测p27及HIF-1α表达情况。光学显微镜采集图像，光密度图像分析仪分析平均光密度。

1.2.2 构建下咽癌裸鼠皮下移植瘤模型：①构建荷瘤鼠：将混悬均匀的人下咽癌细胞株Fadu细胞悬液注射于裸鼠右侧腋背部皮下，每只注射0.2 ml，约(2～4)×107个细胞，共接种2只。接种7 d左右，接种部位皮下可触及小米粒大小硬结；接种2周后移植瘤直径约为1.5 cm。②构建移植瘤模型：脱颈处死荷瘤鼠，剖出瘤块，剪碎成体积为1 mm3左右的瘤块，于裸鼠背部偏右侧皮肤剪一V型小口，将剪好的小瘤块自小口塞入皮下，并于皮下推至右侧腋背部，分笼饲养。

1.2.3 裸鼠分组：将接种瘤块的20只裸鼠分笼饲养，每笼6或7只，观察成瘤情况。每日测量肿瘤的长、短径，计算肿瘤体积(体积=π/6×A×B2，A为长径，B为短径，π/6≈0.52)[11]。待移植瘤长至约60 mm3时，选取15只瘤块较均匀的裸鼠，随机均分为对照组(不给予二甲双胍)、低剂量二甲双胍治疗组(met 40组，每日40 mg/kg)和高剂量二甲双胍治疗组(met 200组，每日200 mg/kg)。

1.2.4 二甲双胍干预及观察抑瘤率：采用腹腔注射给药，每日1次，连续注射28 d。开始药物干预后，每日观察裸鼠的一般情况(精神、饮食、活动、二便、皮肤、毛发等)，每4 d测量裸鼠的体重，测量移植瘤长、短径并计算肿瘤体积。干预结束时留取肿瘤组织测量肿瘤体积，计算药物抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)×100%[11]。

1.2.5 细胞形态学观察：取移植瘤石蜡标本后切片，采用苏木素-伊红染色法观察凋亡细胞的形态学特征。

1.2.6 肿瘤组织目的蛋白的表达：应用免疫组织化学染色检测肿瘤组织目的蛋白表达。石蜡切片常规脱蜡及水化，抗原热修复，滴加一抗、二抗，置于VECTASTAIN ABC反应液中，DAB显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明、中性树胶封片。光学显微镜下采集图像，胞核或胞浆呈棕黄色者为阳性，光密度图像分析仪分析平均光密度，用平均光密度值量化蛋白表达强度，平均光密度值越大表示蛋白表达越强。

2 结果

2.1 二甲双胍对下咽癌Fadu细胞体外增殖的作用 人下咽癌Fadu细胞p27蛋白表达定位于胞核，HIF-1α蛋白在胞核和胞浆中均有表达(图1)；p27蛋白表达0 mmol/L组为0.150±0.025，5 mmol/L组干预24 h时为0.167±0.025、干预48 h时为0.192±0.035，10 mmol/L组干预24 h时为0.275±0.06；HIF-1α蛋白表达对照组为0.252±0.087，5 mmol/L组干预24 h时为0.213±0.060、干预48 h时为0.181±0.037，10 mmol/L组干预24 h时为0.160±0.032。见图2。在二甲双胍干预下，人下咽癌Fadu细胞p27蛋白表达明显升高，而HIF-1α蛋白表达明显降低，且呈浓度-时间依赖性，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

图1 二甲双胍作用Fadu细胞p27蛋白及缺氧诱导因子-1α蛋白免疫细胞化学染色所示(SP×200)a.5 mmol/L组干预24 h；b.10 mmol/L组干预24 h；c.5 mmol/L组干预48 h；d.未干预；1.p27蛋白，2.缺氧诱导因子-1α

图2 二甲双胍作用Fadu细胞p27蛋白及缺氧诱导因子-1α蛋白表达与对照组比较，aP<0.05

2.2 二甲双胍对下咽癌移植瘤生长的影响 药物干预结束时对照组肿瘤体积为(488.76±37.29)mm3，met 40组肿瘤体积为(374.86±42.16)mm3、抑瘤率为(23.30±7.17)%，met 200组肿瘤体积为(290.77±25.34)mm3、抑瘤率为(40.51±9.25)%。见图3。与对照组相比，met 40组和met 200组肿瘤体积均显著被抑制，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示二甲双胍可以抑制下咽癌裸鼠移植瘤的生长。

图3 二甲双胍对下咽癌移植瘤生长的影响

a.未干预组；b.每日40 mg/kg干预组；c.每日200 mg/kg干预组

2.3 移植瘤组织形态学特征 移植瘤细胞大小、形态不一，有明显异型性，核大深染，核仁明显，可见核分裂象，细胞形状不规则，呈巢状、团块状或条索状密集排列，以少量间质间隔。肿瘤组织内可见均匀染色片状分布的粉红色坏死区域。met 40组、met 200组及对照组移植瘤细胞形态无差异，见图4。

图4 下咽癌裸鼠移植瘤组织形态学特征(HE染色)a.未干预组×100；b.未干预组×400；c.每日40 mg/kg干预组×400；d.每日200 mg/kg干预组×400

2.4 p27、HIF-1α在二甲双胍诱导下咽癌细胞凋亡中的作用 免疫组织化学染色结果显示，p27蛋白在肿瘤细胞胞核中表达，HIF-1α蛋白在胞核和胞浆中均有表达。见图5。p27蛋白表达对照组为0.281±0.056，met 40组为0.340±0.103，met 200组为0.421±0.085；HIF-1α蛋白对照组为0.308±0.052，met 40组为0.275±0.048，met 200组为0.226±0.047。结果显示：p27蛋白表达随给药浓度增加而增加，HIF-1α蛋白表达随给药浓度增加而降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图6。

图5 二甲双胍干预下咽癌移植瘤p27蛋白及缺氧诱导因子-1α蛋白免疫组织化学染色(×400)a.未干预组，b.每日40 mg/kg干预组，c.每日200 mg/kg干预组；1.p27蛋白，2.缺氧诱导因子-1α

图6 二甲双胍干预下咽癌移植瘤p27蛋白及缺氧诱导因子-1α蛋白表达

对照组为未干预组，met 40组为每日40 mg/kg干预组，met 200组为每日200 mg/kg干预组；与对照组比较，aP<0.05

3 讨论

本课题组前期对下咽癌细胞体外实验研究发现，二甲双胍可通过阻滞细胞周期循环和诱导细胞凋亡抑制下咽癌细胞增殖[12]。研究中我们发现，下咽癌Fadu细胞经二甲双胍处理后呈现凋亡的形态学变化[12]，与此同时经二甲双胍处理后的移植瘤同样呈现生长抑制状态，而这些变化与药物浓度及作用时间呈正相关[13]。研究发现，在细胞周期的一系列调节因子中，只有G1期的调节因子出现改变或突变进而引起细胞增殖的不可控性，才可能导致肿瘤的发生[14]。我们的前期实验研究已经证实，二甲双胍干预Fadu细胞后细胞周期被阻滞于G1期,结合前期研究及有关细胞凋亡研究的现状，我们推测p27及HIF-1α蛋白参与了二甲双胍介导的下咽癌细胞的增殖与凋亡过程。故本实验我们分别通过干预体外下咽癌Fadu细胞及体内裸鼠移植瘤，并应用免疫细胞化学和免疫组织化学的检测方法，进而从基因转录水平证实二甲双胍的调控机制与p27及HIF-1α表达的相关性。

本课题组前期研究分别从体外和体内实验检测了二甲双胍可以将瘤细胞阻滞于G1期，至少部分通过AMPK-p53-p21、cyclinD1相关的信号传导通路发挥对下咽癌细胞的增殖抑制作用，提示二甲双胍可以通过对AMPK、p21的正性调控及对cyclinD1的负性调控作用，抑制下咽癌细胞的增殖[12-13]。p27与p21同为p53下游的相关周期调控蛋白[15-16]，而cyclinD1/CDK复合物的功能之一即是连接或隔离p27，从而防止p27阻断cyclinD1/CDK复合物的形成，使瘤细胞可从G0/G1期顺利进入S期，即推测随cyclinD1被抑制，减少对p27的阻断，可以阻滞瘤细胞向S期转化[17]。p27可以阻止一系列启动细胞向S期转化必需的靶分子磷酸化，从而抑制细胞G1期相关CYC-CDK复合物及CYCB-CDC2复合物的合成，其过表达可诱导细胞G1/S期阻滞[18],而其表达下降可降低对正性调控细胞周期蛋白的抑制作用，致细胞过度增殖乃至肿瘤形成[19]。本实验无论是体内还是体外实验，均发现在二甲双胍干预下p27蛋白表达显著上调，说明二甲双胍可通过上调抑癌基因p27蛋白表达水平，调控细胞周期、抑制细胞分裂，最终抑制肿瘤生长。

另外，众多实验研究证实，绝大部分实体肿瘤内部为缺氧微环境，细胞缺氧应答的关键环节是HIF-1α的活化，活化的HIF-1α参与调控多种靶基因的转录，影响肿瘤细胞的能量代谢及增殖和凋亡，进而使肿瘤细胞产生一系列反应适应缺氧环境，促进肿瘤血管生成，增强肿瘤的侵袭性及放化疗抵抗[20]。二甲双胍可以通过降低肿瘤细胞氧耗，抑制HIF-1α的聚集[21]，并作用于HIF-1α上游相关信号传导通路(AMPK-mTOR-HIF-1α通路)，激活AMPK及上调DICER的表达，抑制HIF-1α的合成，使HIF-1α的表达量减少，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。本研究发现二甲双胍可抑制HIF-1α的表达，进而抑制肿瘤生长。

目前研究提示，二甲双胍可抑制线粒体复合体I活性、降低氧耗，降低HIF-1α表达水平，抑制肿瘤细胞生长及提高肿瘤对放化疗敏感性[22]。同时我们前期实验也已证实，二甲双胍可增强顺铂及紫杉醇的药物敏感性[12]。故在后期研究中，我们可在本实验的基础上进一步联合应用化疗药物，探索二甲双胍的化疗增敏作用，为临床单独应用二甲双胍及联合化疗药物治疗下咽癌提供更多的理论基础。

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Effects of p27 and HIF-1α on Metformin Impacting Proliferation and Apoptosis of Hypopharyngeal Carcinoma Cells

SHAN Shan1, LI Xiao-ming1, ZHOU Chen-yang2, MIAO Yu-hua1

( 1. PLA Bethune International Peace Hospital ENT, Shi Jiazhuang 050082, China; 2. PLA 401 Hospital ENT, Qingdao 266071, China)

Objective To investigate the effects of metformin on cell proliferation and apoptosis in human hypopharyngeal carcinoma cells in vitro and in vivo, and to observe the mechanism of p27 and hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) in above, we can explore the theoretical basis of metformin for the clinical treatment. Methods Fadu cells in vitro were treated with different concentrations(0、5、10 mmol/L) metformin for 24 h, and with 5 mmol/L medicine for 48 h, to examine the expressions of p27 and HIF-1α by immunocytochemistry. The hypopharyngeal carcinoma xenografts in nude mice model were randomized into control group, low-dose metformin treatment group ( met 40 group, daily 40 mg/kg) and high-dose metformin treatment group ( met 200 group, daily 200 mg/kg). 28 days treatment by intraperitoneal injection later, we collect the tumor, measure their volume, calculate tumor inhibition ratio and observe the tumor morphology by HE. Then the tumors were used for immunohistochemical analyses to detect p27 and HIF-1α. Results Compared with the control group, the expressions of p27 were higher in the hypopharyngeal carcinoma cell in vitro by metformin dose-and-time dependent (P<0.05), nevertheless, the expressions of HIF-1αwere lower(P<0.05). The average volumes of hypopharyngeal carcinoma xenografts of the two metformin treated groups were significantly low compared with that of the control group. And the expressions of p27 were higher and of the HIF-1α were lower than those in cells untreated with metformin(P<0.05). Conclusion Metformin can inhibit the growth and promote apoptosis of hypopharyngeal carcinoma cell in vitro and in vivo effectively, to provide the basis for the clinical treatment of hypopharyngeal carcinoma.

Metformin; Hypopharyngeal neoplasms; Fadu cell; p27; HIF-1α； Cell proliferation; Apoptosis

河北省卫生厅医学科学研究重点课题计划项目(1120140041)

050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院耳鼻咽喉头颈外科(单珊、李晓明、苗玉花)；266071 青岛，解放军401医院耳鼻咽喉头颈外科(周晨阳)

李晓明，E-mail:xmlmo@126.com

R-332；R977.15

A

1002-3429(2017)04-0094-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.04.034

2016-11-08 修回时间：2017-01-03)