牵牛子水煎液对阿霉素肾病模型大鼠肾脏的保护作用

徐静，王宇，李霄，王斌，孟永海，匡海学，王秋红

(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

牵牛子水煎液对阿霉素肾病模型大鼠肾脏的保护作用

徐静1，王宇1，李霄1，王斌1，孟永海1，匡海学1，王秋红2*

(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

目的：观察牵牛子水煎液对阿霉素肾病模型大鼠肾脏的保护作用。方法：采用尾静脉注射阿霉素的方法建立大鼠肾小球硬化模型。考察牵牛子水煎液低、中、高剂量(0.21 g/kg，0.63 g/kg，1.26 g/kg)对阿霉素肾病模型大鼠血清生化指标IL-1β、TNF-α及尿中蛋白含量的影响，并观察肾脏病理改变。结果：与空白组比较，模型组白蛋白、总蛋白、丙氨酸氨基转移酶的含量明显降低；总胆固醇、总甘油三酯、血肌酐和尿素氮的含量明显升高；IL-1β、TNF-α和尿中蛋白浓度明显升高；肾小球上皮细胞肿胀明显，肾小球毛细血管瘀血并部分闭塞，系膜基质重度增生呈弥漫性分布。与模型组比较，牵牛子中剂量可以升高血清中白蛋白、总蛋白、丙氨酸氨基转移酶的水平，降低总胆固醇、总甘油三酯、血肌酐、尿素氮、IL-1β、TNF-α及尿中蛋白浓度。光镜检查结果显示牵牛子中剂量组肾小球上皮细胞肿胀及肾小球系膜基质增生的程度明显减轻。结论：牵牛子水煎液中剂量为有效剂量，它可以提高肾小球的滤过功能，调节血浆胶体渗透压的平衡及血脂紊乱，减轻上皮细胞肿胀及肾小球系膜基质增生，从而改善肾病综合征表症，对肾脏具有保护作用。其作用机理可能与降低炎性因子含量有关。

牵牛子；阿霉素肾病；肾小球硬化；白介素-1β；肿瘤坏死因子-α

肾小球疾病是指以肾小球损害为主的变态反应性炎症，是较为常见的疾病。其临床表现为蛋白含量降低，肾小球滤过功能下降，血脂含量升高等肾病综合征。阿霉素肾病模型病理及生理改变类似于人类的微小病变型肾病，且模型制备简单方便[1-3]。传统利水中药牵牛子具有泻水通便、消痰涤饮等功效，常用于水肿胀满，二便不通，痰饮积聚，气逆喘咳等病症[4]。本实验选用阿霉素诱导大鼠肾小球硬化，通过观察不同浓度牵牛子水煎液对阿霉素肾病大鼠血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇、总甘油三酯、血肌酐、尿素氮、丙氨酸氨基转移酶、白介素-1β和肿瘤坏死因子指标和尿中蛋白浓度的变化，以及肾脏病理改变，探讨牵牛子水煎液对阿霉素肾病模型治疗作用及作用机制，为下一步性味拆分组分药效学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物

牵牛子药材购自哈尔滨市药材公司(产地：山东)，经黑龙江中医药大学中药资源学教研室王振月教授鉴定为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitisnil(L.) Choisy的干燥成熟种子，符合2010版《中国药典》规定。牵牛子水煎液由黑龙江中医药大学中药化学实验室制备提供。选用水煎煮法，获得水煎液后，经萃取、大孔树脂、醇沉等步骤，将牵牛子水煎液拆分为互不交叉的4个组分脂肪油组分、多糖组分、酚酸组分、树脂苷组分。制备流程见图1。

图1 牵牛子水煎液及拆分组分制备流程

100 g牵牛子，按照确定的牵牛子性味物质基础拆分工艺，拆分获得水煎液39 g、脂肪油组分1.6 g、多糖组分23.1 g、酚酸组分8.0 g、树脂苷组分6.3 g。即水煎液的提取率为39%。中国药典中记载牵牛子用药量为3～6 g，6 g×0.018=0.108 g，即0.108 g生药量/200 g大鼠×1倍量×39%提取率=0.21 g/kg，即牵牛子给药剂量为低剂量0.21 g/kg，中剂量0.63 g/kg，高剂量1.26 g/kg，比例为1∶3∶6(相当于生药0.054 g/kg,1.62 g/kg,0.324 g/kg)。取108 g干燥牵牛子水浸泡过夜，加入10倍水煎煮提取3次，每次2 h，合并滤液后浓缩至1 000 mL，浓度为0.054 g/mL生药量，大鼠按照1 mL/100 g标准给予灌胃治疗。

1.2 动物

SD大鼠50只，7～8周龄，体质量220～240 g，雄性，SPF清洁级，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号SCXK(黑)20130004号。

1.3 试剂

盐酸阿霉素注射液10 mg/瓶(山西普德药业股份有限公司，生产批号：H14023143)；白蛋白(南京建成生物工程研究所，批号：151411)、总蛋白(南京建成生物工程研究所，批号：151261)、总胆固醇(南京建成生物工程研究所，批号：151871)、总甘油三酯(南京建成生物工程研究所，批号：167451)、肌酐(南京建成生物工程研究所，批号：153281)、尿素氮(南京建成生物工程研究所，批号：161281)、丙氨酸氨基转移酶(南京建成生物工程研究所，批号：162531)；大鼠肿瘤坏死因子-α(优而生，批号：L161123029)、白介素-1βELISA试剂盒(优而生，批号：L160818450)、BCA蛋白定量(康为世纪，批号：07112017)。

1.4 仪器

AB265-S电子分析天平(瑞士梅特勒公司)，2-16P高速离心机(德国sigma公司)，魅力2000全自动生化分析仪(美国百昂集团仪器公司)，Victor X3型酶标仪(美国Perkin Elemr公司)。

1.5 实验方法

适应性饲养1周，随机分为五组，分别为空白组、模型组、牵牛子低剂量组、牵牛子中剂量组、牵牛子高剂量组。每组10只。自由饮水、饮食。

参照Bertain等文献[1]进行阿霉素模型的制备。将阿霉素用生理盐水稀释成0.4 mg/mL的注射液，第1天按4 mg/kg大鼠体质量尾静脉注射阿霉素，第8天以同样方法按3.5 mg/kg大鼠体质量注射阿霉素[5]。第11天开始给予牵牛子水煎液低、中、高剂量(0.21 g/kg，0.63 g/kg，1.26 g/kg)治疗干预，周期为14天。第24天给药后上代谢笼收集24 h尿液，用BCA蛋白定量试剂盒测定尿蛋白浓度。第25天，用乌拉坦麻醉后腹主动脉取血，离心取上清液并存于-80℃待测。用生化仪检测血清中白蛋白、总蛋白、总胆固醇、总甘油三酯、血肌酐、尿素氮、丙氨酸氨基转移酶。用酶联免疫试剂盒(ELISA法)检测IL-1β和TNF-α含量的变化，并观察其肾脏病理改变。

1.6 统计学分析方法

2 结果

2.1 对血清中白蛋白、总蛋白和丙氨酸氨基转移酶含量的影响

表1 牵牛子对阿霉素肾病大鼠血清白蛋白、总蛋白、丙氨酸氨基转移酶含量的影响

注：与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表1可见，与空白组比较，模型组白蛋白、总蛋白、丙氨酸氨基转移酶指标含量明显降低，均具有极显著性差异，证明模型建立成功。与模型组比较，在白蛋白指标中，牵牛子中剂量组指标含量明显升高，具有显著性差异；在总蛋白指标中，牵牛子中剂量组指标含量明显升高，具有显著性差异；在丙氨酸氨基转移酶指标中，牵牛子低、中、高剂量组指标含量明显升高，其中牵牛子低剂量组具有显著性差异，牵牛子中、高剂量组具有极显著性差异。

2.2 对血清中总胆固醇、总甘油三酯、血肌酐和尿素氮含量的影响

由表2可见，与空白组比较，模型组总胆固醇、总甘油三酯、血肌酐和尿素氮含量明显升高，均具有极显著性差异，证明模型建立成功。与模型组比较，在总胆固醇指标中，牵牛子中剂量组含量明显降低，具有显著性差异；在总甘油三酯指标中，牵牛子中剂量组指标含量明显降低，具有显著性差异；在血肌酐指标中，牵牛子中剂量组指标含量明显降低，具有显著性差异；在尿素氮指标中，牵牛子中、高剂量组指标含量明显降低，其中牵牛子中剂量组具有极显著性差异，高剂量组具有显著性差异。

表2 牵牛子对阿霉素肾病大鼠血清总胆固醇、总甘油三酯、血肌酐和尿素氮含量的影响

注：与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 对血清中IL-1β、TNF-α含量的影响

表3 牵牛子对阿霉素肾病大鼠血清IL-1β、TNF-α含量的影响

注：与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表3可见，与空白组比较，模型组IL-1β和TNF-α含量明显升高，均具有极显著性差异，证明模型建立成功。与模型组比较，牵牛子中剂量组IL-1β和TNF-α含量明显降低，具有显著性差异。

2.4 对尿中蛋白浓度的影响

表4 牵牛子对阿霉素肾病大鼠尿中蛋白浓度的影响

注：与空白组比较，▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表4可见，造模前各组大鼠尿中蛋白浓度无明显差异；处死前检测尿中蛋白浓度，与空白组比较，模型组尿中蛋白浓度明显升高，具有极显著性差异。与模型组比较，牵牛子中、高剂量组尿中蛋白含量均明显降低，其中，牵牛子中剂量组具有极显著性差异。

2.5 肾组织病理学改变

实验结果见图2。光镜下可见，空白组肾小球无肿胀，无充血，无系膜基质增生，肾管型、肾曲管结构正常。模型组大部分肾小球上皮细胞肿大，肾小球毛细血管充血，出现蛋白管型，球囊壁纤维化，系膜基质中度或重度增生。牵牛子中剂量仅小部分肾小球肿胀，呈轻度系膜增生。其余各组可见大量蛋白管型及胶样管型，肾小球萎缩。

图2 各组肾脏组织HE染色(×400)

3 讨论

牵牛子味苦、辛，性寒。归肺经、肾经、大肠经。具有泻下、利尿、消肿、驱虫等功效，主治肢体水肿、肾炎水肿、肝硬化腹水、便秘、虫积腹痛等症[6]。《本草》名医续注云，味苦寒能除湿，利小水，治下疰脚气。凡药中用牵牛者，少则动大便，多则下水，此乃泻气之药。现代药理研究表明，牵牛子具有利尿作用[7]，提高肾小球滤过功能；具有泻下作用、增加大肠小肠蠕动；增加平滑肌作用，兴奋子宫[8-9]；具有抗菌作用，可增长抑制率[10]。其中利尿作用尤为突出，张颂等[7]实验研究表明牵牛子能加速菊糖在肾脏中的排出。孙延平等[11]实验研究表明牵牛子具有利尿、增加大肠(小肠)推进、胃排空、化痰、抗炎等药理作用。临床研究表明，尚学瑞[12]也发表了牵牛子治水肿验方。任建素[13]在治疗慢性肾炎患者面浮肢肿、尿少尿闭等情况时，常在健脾益肾、化瘀通络的基础上，配伍牵牛子等利水中药，采用逐水法使水湿从二便排出，调节水液代谢。余明[14]实脾饮加味治疗慢性肾小球肾炎187例。牵牛子是该方的君药，起主要作用。不过大量服用牵牛子也会产生毒副作用，胃肠、对肾脏、神经系统都有影响[15]。

本实验选用阿霉素诱导大鼠肾小球病变，该模型制备简单方便,较好复制。阿霉素可损害细胞生物膜，影响线粒体的氧化磷酸化过程，利用其肾毒性可造成与人类肾小球硬化相似的病理改变。阿霉素模型大鼠具有血清总蛋白、白蛋白含量降低，血肌酐、尿素氮及血脂含量升高等肾病综合征表现。血清肌酐和尿素氮都是机体蛋白质代谢产物，它们的浓度取决于氮的分解和肾的排泄功能，在摄入食物及体内代谢比较稳定的情况下，其浓度的多少取决于肾的排泄能力，因此，血肌酐和尿素氮浓度在一定程度上反映肾小球的滤过功能[16]。与肾脏疾病相关的细胞因子很多，TNF-α和IL-1β是重要的致病炎症因子。其中，TNF-α可直接或间接损伤肾小管内皮细胞，刺激肾小球系膜细胞产生大量引起凝血的物质，促使肾小球基底面通透性的改变，从而加重肾小球的损伤[17]；IL-1β能够引起肾小球内凝血，刺激肾小球系膜细胞基质增生，使肾小管间质纤维化，最终导致肾小球硬化[18]。

牵牛子中剂量能明显升高血清中蛋白浓度，降低血肌酐、尿素氮、尿蛋白的浓度；改善血脂含量，降低总甘油三酯、总胆固醇浓度；降低血清TNF-α和IL-1β水平含量；减轻肾小球系膜基质增生。综合评价后得出牵牛子中剂量能提高肾小球的滤过功能，调节血浆胶体渗透压的平衡及血脂紊乱，减轻上皮细胞肿胀及肾小球系膜基质增生，从而改善肾病综合征表症，对肾脏具有保护作用。作用机制可能通过降低一系列炎性细胞因子的含量，从而达到缓解水肿的疗效。研究表明牵牛子中剂量为最佳剂量，对下一步实验中性味拆分组分药效学研究提供依据，也为进一步证明中药性味拆分理论“一味一性”“一药X味Y性(Y≤X)”的假说提供科学依据[19]。

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2016-11-25

2016-12-30

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2013CB531801)

徐静(1986-)，女，博士，从事中药药效物质基础研究。

*通讯作者：王秋红(1969-)，女，博士，教授，从事中药炮制研究、中药药效物质基础研究和新药开发。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0005-04