戊酸雌二醇对大鼠胎鼠睾丸及睾丸引带的影响*

张 炜，林 虹，王玉莲

(汕头大学医学院第一附属医院泌尿外科，广东 汕头 515041)

隐睾症早产儿发病率约为30%，健康新生儿约为3%，3月时约为1%。隐睾时因睾丸长期留在腹腔内或腹股沟管里，受体内“高温”的影响，容易造成男性不育[1]。在助孕治疗领域中，体外受精-胚胎移植和冷冻胚胎移植中经常使用较大剂量的雌激素促进子宫内膜生长以利胚胎种植，一旦妊娠，持续用药至妊娠12周胎盘功能建立后停药，这就使早孕期处于器官分化发育关键时期的胚胎一直暴露在母体循环中的高雌激素环境[2-3]。研究显示，雌激素样化合物可直接作用于胚胎生殖器官和通过干扰内分泌系统，影响胚胎发育及性腺发育，几乎可引起各种形式的雄性生殖系统发育障碍，睾丸小、无精子及尿中促性腺激素增高等统称为睾丸发育不全综合征[4-5]。本课题通过动物实验，在早孕期给予大鼠戊酸雌二醇，建立高雌激素状态的动物模型，观察娩出的雄性子代出现睾丸发育不全综合征的情况，观察胎鼠睾丸及睾丸引带外观，生殖系统的使用功能和结构的影响,探究出睾丸下降不全的相关因素。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康、性成熟的SD大鼠40只,由广东省实验动物中心提供；其中雌性30只,雄性10只,体重180～230 g，喂养于实验动物中心(SPF级)，室温22℃～25℃ ,湿度40%～55%,昼夜周期为12/12 h。

1.2 动物模型的建立

大鼠合笼交配，每天早晚两次检查雌鼠有无出现阴道栓，并行阴道涂片，以阴道涂片显微镜下见到精子确定受孕，孕鼠随机分配各组进行实验。

根据医学产品生殖毒性检测指导原则，选择早孕期大鼠给予戊酸雌二醇建立动物模型。受孕大鼠随机分为4组：对照组、低剂量组(1.0 mg/kg )、中剂量组(1.5 mg/kg )和高剂量组(2.0 mg/kg )。以上共4组每组至少6只孕鼠,从孕鼠孕6～ 15 d每天1次连续灌胃给予戊酸雌二醇(法国LYS LEZLANNOY出品，进口药品注册证号:H20030177) ， 戊酸雌二醇溶解于生理盐水1m，对照组给生理盐水1 mL。孕鼠分娩的雄性子代，正常饲养至出生后60 d。处死各组雄性子鼠并取睾丸进行观测。

1.3 标本采集及测量

摘取睾丸、附睾，电子天平称重，计算脏器系数(睾丸或附睾重量/大鼠体重100)；睾丸放入10%甲醛液中固定24 h以上，常规石蜡包埋、切片、HE染色，在100光镜下观察生精小管的形态学变化，每只大鼠睾丸横切面切片中随机选取10个的生精小管测其直径，图像分析软件Image-pro-plus 6.0进行手动选定测量，测量方法：生精小管直径为过中心两固有层外界之间的距离，生精上皮高度为基膜上界到生精小管生精上皮顶端的距离，取平均值用于分析睾丸发育情况。

根据在较高温度下(32℃～ 35℃ ， 30 min )睾丸不能坠入阴囊判定为隐睾。隐睾评分：睾丸位于腹腔内：3分；腹股沟区：2分；皮下环处：1分；阴囊内：0分。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 存活率

对照组(A)娩雄性子代18只、低剂量组(B)娩雄性子代17只、中剂量组(C)娩雄性子代19只、高剂量组(D)娩雄性子代17只。各组仔鼠存活率较对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 体重、附睾睾丸重量和脏器系数

雄性子代的体重、附睾睾丸重量和脏器系数中、高剂量组与对照组、低剂量组观察比较，差异有统计学意义(P<0.05)，以高剂量组的系数为最低。见表1。

表1 对照组和低、中、高剂量组雄性子代的体重、附睾睾丸重量和脏器系数

2.3 各组的隐睾发生率

各组的隐睾发生率分别为5.5%(2/36)、35.8%(2/34)、34.2%(3/38)， 58.8%(20/34)；对照组、低剂量组两组隐睾发生率对比，差异无统计学意义(P>0.05)，中、高剂量组组与对照组对比，有明显差异，有统计学意义(P<0.05) ， 而中、高剂量组之间差异有显著性(P>0.05)，高剂量组的发生率为最高。见表2。

表2 对照组和低、中、高剂量组雄性子代的隐睾评分

注：单双侧隐睾为例数。每侧为双侧，故此表中除组别项，其他项例数翻倍。

3 讨论

到现在,睾丸下降不全的的病因还不能确定，睾丸下降不全是指睾丸下降障碍，停留在下降过程的途中，未能进入阴囊[6]。临床上也习惯称为隐睾症，是先天性疾病。睾丸下降不全的原因有很多，例如遗传因素：有大多数人隐睾病人有家里遗传的情况，所以遗传也可能是睾丸下降不全的机制[7]。隐睾的发生可能还有其他的因素，跟随着社会日新月异的进步，科学医疗水平都在日益的提高，一定会找出治疗睾丸下降不全的有效方法，从而抑制隐睾这种疾病的发生；内分泌因素：睾丸的下降胎儿睾丸间质细胞产生雄激素是要靠母体的促性腺激素，假若促性腺激素不产生下降说明睾丸自身发育有缺陷，而促使隐睾[8-11]，因为血液中促性腺激素浓度非常高时睾丸下降发生，当母体本身缺少促性腺激素时，也会发生隐睾。器质性因素：导致隐睾的器质性因素主要有睾丸系带很短或缺，如睾丸系膜发生粘连、精索的血管或输精管太短、睾丸畸形发育以及阴囊发育不正常等[12]。雌激素的作用同样需与其受体结合后方可发挥其生物效应，在Ivell、Raivio、Emmen、Shono等都发现了可诱发睾丸引带发育迟缓改变， 可以会影响雄性生殖系统发育并且使正常内分泌功能紊乱，使泌尿生殖系统发生了畸形。

目前国内外对戊酸雌二醇安全用药方面的研究主要集中在评价其作为避孕药及绝经期激素替代治疗方面，而对子宫内早期接触戊酸雌二醇后对性成熟期雄性子代生育能力的影响较少关注,文献仅见从致死率及畸形率来评价戊酸雌二醇的胚胎毒性，而未见评价子代成年后的生育能力。我们在本研究中发现戊酸雌二醇在早孕期注射低剂量未观察到雄性子代的生殖系统发育有什么异样，这与我们先前的研究结果基本一致。然而中剂量以及高剂量的戊酸雌二醇却显著引起隐睾的发生，其中、高剂量组双侧隐睾的发生率为29.4%(5/17)，为各组最高。中、高剂量组的隐睾评分均明显升高，表明了外源性雌激素对雄性子代明显影响睾丸的下降及发育，高剂量组隐睾下降不全程度最为严重[14-15]。我们推测： Insl3诱导的睾丸引带细胞增生和阻止雄激素的促进颅侧悬韧带退化可以使用外源性雌激素将拮抗雄激素受体，阻止睾丸引带经历逐渐发育、生长扩张腹股沟管,随后又逐渐缩短、退化,从而牵引睾丸下降的过程。

对子宫内激素环境的改变最明显的是动物生殖系统。生殖系统发育有所改变是由于雄性动物在子宫内的外源性雌激素的暴露，而且雌激素活性物质对啮齿动物生殖毒性的作用敏感性与特定的胚胎发育关键时间相关。Fisher等采用具有雌激素样活性的邻苯二甲酸酯(DBP)诱发的动物模型显示：给妊娠期母鼠一定剂量的DBP后其不同日龄的雄性子代睾丸重量均明显低于对照组，子代成年后约80%出现不育，睾丸发育不良。

附睾、睾丸的重量是这两种器官的传统的定量指标，而且睾丸重量与生殖细胞数量密切相关,睾丸重量及睾丸组织病理学效应对生育力有较大的预测价值。睾丸组织学方面其量化指标包括生精小管直径和上皮高度， 就辨别生精损坏的程度来说，其价值要比睾丸重量测定要大。睾丸在受到毒物作用后，影响到生精过程,必然引起生精上皮细胞的退化，失去正常的生精相， 使上皮变薄，生精小管内精子减少或消失。睾丸的各种病理变化最终都造成生精小管的萎缩，因此，睾丸生精小管管腔直径和上皮高度的变化，能在一定程度上反映睾丸的损伤情况[16]。

此次研究利用戊酸雌二醇提示睾丸质量有所改变，并且发现了有不同程度发育缺陷，发现组织结构排列紊乱，生精上皮层次变薄，曲细精管发生退行性变化，睾丸不能产生成熟的精子，并且支持细胞和生精细胞出也现了故障，从而得出了戊酸雌二醇能对睾丸的生精细胞成熟和细胞发育有很大影响。大量的戊酸雌二醇使睾丸中的Leydig细胞大量增多，而且睾丸间质组织产生增生。经过此次研究发现戊酸雌二醇影响T的合成和对AR受体的拮抗作用， 产生抗雄激素效应，通过下丘脑-垂体-性腺轴负反馈调节，导致睾丸Leydig细胞反应性增生。通过实验里的各组各项指标与对照组对比，差异有统计学意义，证明外源性雌激素给药对胎鼠性别和身体的发育没有显著的影响。

综上所述，根据此次研究证明戊酸雌二醇能使大鼠睾丸下降出现问题，同时睾丸间质细胞的能力得到改变睾丸分泌睾酮降低。

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