麦胚球蛋白的体外抗炎活性研究

毕振原，黄继红，2*，刘 娜，冯军伟，纪小国，李海月，赵 祎，张亚奇

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省食品工业科学研究所有限公司，河南 郑州 450000）

麦胚球蛋白的体外抗炎活性研究

毕振原1，黄继红1，2*，刘 娜1，冯军伟1，纪小国1，李海月1，赵 祎1，张亚奇1

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省食品工业科学研究所有限公司，河南 郑州 450000）

麦胚球蛋白是一种优质蛋白，在改善身体机能和消除炎症方面有着重要的研究价值。通过脂多糖（LPS）干预巨噬细胞建立炎症细胞模型，对提取麦胚球蛋白的体外抗炎活性进行了探究。通过体外细胞培养研究了麦胚球蛋白对RAW264.7细胞的细胞毒性；利用Griess法研究了麦胚球蛋白对RAW264.7细胞经LPS诱导前后NO产生量的影响；利用ELISA法检测实验组对炎症细胞模型中细胞因子TNF-α含量的影响。结果表明：麦胚球蛋白能显著降低经LPS诱导RAW264.7细胞因子TNF-α和NO的含量，并存在一定的剂量依赖关系。麦胚球蛋白抗炎活性的研究为功能性保健品及抗炎药品原料开发提供了思路。

麦胚球蛋白；RAW264.7细胞；炎症细胞模型；抗炎活性

网络出版时间：2017-4-20 14:09:31

0 引言

小麦是人类历史上最早被人工栽培的粮食作物之一，有“五谷之尊”的美誉。小麦胚芽是小麦籽粒的生命中枢，质量相当于整粒小麦的2%左右，却蕴含着其97%的营养，被营养学家美誉为“人类天然的营养宝库”，营养丰富，功能全面[1]。麦胚蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，分别占26%和20%左右[2]。到目前为止，国内外研究的重点大都是麦胚清蛋白，且研究表明其主要组成是一些蛋白酶类[3-4]；而对麦胚球蛋白的关注程度较小，尚未成为主要研究对象。

巨噬细胞源自单核细胞，是免疫效应细胞，可以对细胞残片及病原体进行吞噬以及消化，并通过释放细胞因子等激活免疫系统中的其他细胞，具有免疫防御、免疫监视、免疫调节以及抗原呈递等多种免疫功能，在机体的免疫系统中起重要作用[5-7]。NO是激活巨噬细胞杀灭病原微生物及肿瘤细胞的主要效应分子，能提高机体免疫力，但过量的NO也会促进炎症发生，对组织造成损伤[8-10]。

本研究通过体外培养巨噬细胞观察了麦胚球蛋白对经脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞因子（TNF-α）和一氧化氮的产生量，从细胞水平研究麦胚球蛋白的抗炎活性，为研究麦胚球蛋白的抗炎活性及其作用机制提供理论和实验依据，为麦胚蛋白作为功能性保健品及抗炎药品原料开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

麦胚：河南财鑫糖业有限公司；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）高糖培养液：美国Hyclone公司；四季青优级胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司；双抗贮存液、Hank's溶液：杭州吉诺生物医药技术有限公司；噻唑蓝（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT）、 台 盼 蓝 ： 美 国AMERISCO 公司；脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）：美国Sigma-Aldrich贸易有限公司；0.25%胰酶、TrypLETM Express重组酶：美国Life Technologies公司；肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒：南京建成生物工程研究所；其他化学试剂均为分析纯。

DMEM高糖完全培养液：89%DMEM高糖基础培养液，10%胎牛血清，1%终浓度分别为100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的双抗贮存液。

Griess试剂的配制：称取1 g对氨基苯磺酸，加入100 mL 5%磷酸溶液溶解；再称取0.1 g N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐，加入100 mL 5%磷酸溶液溶解；使用前，将两者等体积混合，即为Griess试剂。

1.2 仪器与设备

Perkin Elmer 1420酶联免疫检测仪：美国；SHELLAB型CO2培养箱；Water Jacketed Incubator：美国；OLYMPUS IMT-2型倒置显微镜：美国；5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 麦胚提取物的制备

将麦胚进行粉碎，然后在料液比为1∶13、NaCl质量分数为3%、温度为30℃的条件下，提取1 h，经离心后，上清即为麦胚球蛋白提取液，冷冻干燥得到麦胚球蛋白[2]。

1.3.2 RAW264.7细胞的复苏

从-80℃冰箱中取出RAW264.7细胞，在37℃水浴中解冻，解冻后将细胞悬液移入无菌离心管中，加入少量的DMEM完全培养液，1 000 r/min离心5 min后弃上清，再加入DMEM完全培养液，吹打均匀后移入培养瓶中，在37℃、5%CO2条件下进行培养[11-12]。

1.3.3 RAW264.7细胞悬液的制备

当RAW264.7细胞长至70%～80%的丰度（对数生长期）时，取出培养瓶，弃掉瓶中的培养基，加入10 mL PBS缓冲溶液洗涤2次，然后加入约1.5 mL 0.25%的TrypLETM Express重组酶进行消化，轻轻晃动培养瓶使重组酶覆盖均匀，将培养瓶置于培养箱中消化5 min。倒置显微镜下观察，当培养瓶中贴壁细胞大部分变为圆状时，即认为消化完全。此时加入10 mL DMEM高糖完全培养液，以终止消化作用，轻轻反复吹打细胞悬液，使细胞从培养瓶壁脱落。然后将细胞悬液移入50 mL离心管，1 000 r/min条件下离心5 min，弃上清后加入适量DMEM完全培养液，混匀后用台盼蓝染色法进行活细胞计数，调整细胞浓度至 5.0×105个/mL[5,13]。

1.3.4 麦胚球蛋白对RAW264.7细胞的毒性

取密度为5.0×105个/mL的细胞悬液，吹打均匀后接种于96孔培养板，100 μL/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中过夜培养24 h。培养结束后吸弃孔内的培养基，对照组每孔加入100 μL DMEM完全培养液，样品组分别加入等量不同质量浓度的样品溶液（终质量浓度为0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL），在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，MTT法检测吸光度，根据公式（1）计算麦胚球蛋白对RAW264.7细胞的存活率[5]。

1.3.5 麦胚球蛋白对未经LPS诱导RAW264.7细胞NO产生量的影响

取密度为5.0×105个/mL的RAW264.7细胞悬液，吹打均匀后以2 mL/孔的量接种于12孔培养板，在37℃、5%CO2条件下过夜培养24 h。培养结束后吸弃孔内的培养基，空白对照组每孔加入500 μL DMEM高糖完全培养液，样品组分别加入500 μL终浓度为0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL样品溶液，在37℃、5%CO2条件下培养24 h。

NO标准曲线的绘制：配制浓度为0、2、5、10、15、30、40、50、60、80、100 μmol/L的 NaNO2溶液，各取100 μL并加入100 μL Griess试剂混合均匀，避光作用20 min后，在535 nm处检测各孔的光吸收值。

细胞培养基中NO含量的检测：培养结束后，各组每孔取培养基上清液 100 μL与 100 μL Griess试剂混合，避光作用20 min后，用DMEM完全培养液作空白对照，在535 nm处检测其光吸收值，通过NO标准曲线计算出各孔NO的含量。

1.3.6 麦胚球蛋白对经LPS诱导RAW264.7细胞NO产生量的影响

细胞种板和培养：取密度为5.0×105个/mL的细胞悬液，吹打均匀后以2 mL/孔的量接种于12孔培养板，在37℃、5%CO2条件下过夜培养24 h。培养结束后吸弃孔内的培养液，空白对照组每孔加入500 μL DMEM完全培养液，LPS对照组、地塞米松阳性对照组、样品组分别加入500 μL 2 μg/mL的LPS溶液，培养0.5-1 h后，空白对照组和LPS对照组每孔加入500 μL DMEM完全培养液，地塞米松阳性对照组每孔加入500 μL终浓度为8 μmol/L的地塞米松溶液，样品组分别加入500 μL终质量浓度为0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL样品溶液，在37℃、5%CO2条件下培养24 h。用Griess法测定细胞培养基上清液中NO的含量。

1.3.7 麦胚球蛋白对经LPS诱导RAW264.7细胞因子含量的影响

ELISA法检测实验组对炎症细胞模型中细胞因子含量TNF-α的影响。细胞干预24 h后取上清液，利用相应的ELISA试剂盒按说明进行操作，测定TNF-α含量，每个试验均设3个重复。

2 结果与分析

2.1 麦胚球蛋白对RAW264.7细胞的毒性

如图1所示，麦胚球蛋白在100～1 600 μg/mL范围内对RAW264.7细胞显示无毒性；并在100～1 600 μg/mL范围内对RAW264.7细胞生长具有显著的促进作用（P<0.01）；随着质量浓度的升高，麦胚球蛋白对RAW264.7细胞的存活率呈上升趋势，当质量浓度为800 μg/mL时，细胞存活率达到最高值，之后出现下降，但是细胞存活率仍显著高于空白组（P<0.01）。表明麦胚球蛋白对RAW264.7细胞无毒性，且对其具有显著的增殖作用。

图1 麦胚球蛋白对RAW264.7细胞的毒性Fig.1 The toxicity of wheat germ globulin against RAW 264.7 macrophages

2.2 不同质量浓度麦胚球蛋白对正常RAW264.7的NO产生量的影响

图2为NO标准曲线，线性回归方程为 y=0.003 1x+0.001 9，R2=0.999 7。图3为不同质量浓度麦胚球蛋白对正常RAW264.7的NO产生量的影响。由图3可知，质量浓度为100 μg/mL时对正常RAW264.7细胞NO产生无显著影响（P>0.05），200～1 600 μg/mL内具有显著的促进作用（P< 0.01）。NO是激活的巨噬细胞杀灭病原微生物及肿瘤细胞的主要效应分子，能提高机体免疫。试验表明，麦胚球蛋白能够显著促进正常RAW264.7的NO产生量。

2.3 不同质量浓度麦胚球蛋白对 LPS诱导RAW264.7的炎症的抑制作用

图2 NO标准曲线Fig.2 The standard curve of NO

图3 不同质量浓度麦胚球蛋白对正常RAW264.7的NO产生量的影响Fig.3 Effect of different concentrations of wheat germ globulin on NO production of RAW264.7 cells

图4 不同质量浓度麦胚球蛋白对LPS诱导RAW264.7的NO产生量的影响Fig.4 Effect of different concentration of wheat germ globulin on NO production of RAW264.7 cells induced by LPS

如图4所示，地塞米松与各质量浓度麦胚球蛋白均能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的产生（P<0.05），但与空白组相比仍有较显著性差异（P<0.01），麦胚球蛋白随着质量浓度的升高抑制效应愈加显著；当麦胚球蛋白质量浓度为100 μg/mL时，其抑制效应显著低于地塞米松（P< 0.05）；当麦胚球蛋白质量浓度为1 600 μg/mL时，其抑制效应显著高于地塞米松（P<0.05）；当麦胚球蛋白质量浓度在200～800 μg/mL范围内，其抑制效应与地塞米松无显著性差异。综上所述，各质量浓度麦胚球蛋白均能显著抑制 LPS诱导的RAW264.7细胞NO的产生的效应，表现出抗炎活性，且当质量浓度为1 600 μg/mL时抗炎活性显著高于地塞米松（P<0.05）。

2.4 不同质量浓度麦胚球蛋白对经 LPS诱导RAW264.7细胞因子（TNF-α）含量的影响

细胞受到有毒性的化学物质或病原体侵袭的时候，机体的免疫系统就会释放出NF-κB。NF-κB是调控许多炎症基因表达的关键转录因子，状态通常是非活性，存在于细胞质中。当细胞受到TNF等刺激时，NF-κB得以活化并从细胞质移到细胞核，启动多种炎症基因表达，使大量的炎症细胞处于发生炎症的部位周围[15]。NF-κB发生核转位是一些免疫和炎症反应的重要步骤，应用NF-κB抑制剂来减少炎症介质的产生成为治疗炎症的新思路。TNF-α在炎症细胞因子产生的级联效应中属于末期的分子，同时也是炎症中起正反馈调控的关键分子，参与多种局部和全身的炎症反应[15-16]。

从图5可以看出，LPS诱导后细胞因子TNF-α的含量与空白对照组比较有极显著的升高（P< 0.01），说明造模成功。而地塞米松与麦胚球蛋白干预组中的TNF-α的含量均显著低于LPS组。其中，当麦胚球蛋白质量浓度为100 μg/mL时，TNF-α的含量显著高于地塞米松组（P＜0.05）；当麦胚球蛋白质量浓度为1 600 μg/mL时，TNF-α的含量显著低于地塞米松组（P＜0.05）。这表明麦胚球蛋白干预后细胞所分泌的炎症介质TNF-α的含量有显著降低，且成一定的剂量依赖关系，表明麦胚球蛋白对促炎因子有明显的抑制作用。

图5 不同质量浓度麦胚球蛋白对LPS诱导RAW264.7的TNF-α产生量的影响Fig.5 Effect of different concentrations of wheat germ globulin on TNF-α production of RAW264.7 cells induced by LPS

3 结论

TNF-α能促使中性粒细胞聚集、内皮细胞黏附分子上调、凝血酶原效应等，在炎性反应、免疫应答的启动和持续过程中具有不可或缺的作用，是炎症反应的核心环节，血清 TNF-α的水平可反映炎症的严重程度[16-17]。试验假设麦胚球蛋白具有抗炎作用，以LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应及抗炎机制普遍模型为研究载体，以TNF-α作为抗炎疗效指标，采用直接干预模式探讨了麦胚球蛋白的抗炎作用。

炎症反应Toll信号传导通路显示，LPS进入细胞主要通过脂多糖结合蛋白 CD14受体和Toll样受体4等信号转导途径，从而引起系列的炎症反应[5,15-16]。RAW264.7细胞受到脂多糖 (LPS)等外界刺激后能够启动体内炎症介质产生并启动机体抵抗炎症系统的功能，激活转录因子细胞核因子NF-κB和活化相关蛋白，引起各种细胞因子和炎症介质的过度表达，引起机体内的炎症多米诺骨牌反应，进一步引起全身炎症反应综合征。一氧化氮 (NO)作为介导炎症反应的关键因子，在外界刺激致机体损伤中起重要作用。一氧化氮在炎症初期，起保护作用，但是过多的 NO可以促进巨噬细胞释放 IL-1、TNF-α等促炎因子，这些促炎性细胞因子可以刺激巨噬细胞分泌产生更多的 NO，形成恶性循环，加重炎症反应，因此能抑制NO分泌产生的物质具有抗炎的作用。

实验研究显示麦胚球蛋白有显著的抗炎作用，各质量浓度麦胚球蛋白对RAW264.7细胞无毒性，能够显著促进正常RAW264.7的NO产生量；各质量浓度麦胚球蛋白均能显著抑制 LPS诱导的RAW264.7细胞NO的产生，且随着质量浓度的升高抑制效应愈加显著；对促炎因子TNF-α有明显的抑制作用，说明麦胚球蛋白在与促炎因子相关的炎症疾病中起到一定的抗击炎症的作用。

虽然试验证实了麦胚球蛋白的良好的抗炎效果，但麦胚球蛋白的抗炎机制及其构效关系还需要做以下工作：（1）麦胚球蛋白的抗炎活性的大小与其分子质量、氨基酸组成、首末段氨基酸、二级结构等关系密切，需要应用高度专一性的分离手段如亲和层析技术、分子印迹技术分离具有高抗炎活性的麦胚球蛋白单体。（2）大量人源化细胞的抗炎效果和对促炎因子的作用需要进一步的深入研究。体外细胞实验和动物实验相结合验证麦胚球蛋白的抗炎效果及对应的剂量关系是未来研究的重点。（3）麦胚球蛋白抗炎过程中，细胞通路的研究如在Toll信号传导通路中的具体的作用位点和机制需要从理论上和实验上做进一步的验证。总之，麦胚球蛋白的抗炎作用的研究可以有效地提高麦胚资源的综合利用，同时也为功能性保健品及药品原料的开发提供了借鉴。

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Abstract：Wheat germ globulin is a kind of high quality protein，which has important research value on improving somatic function and eliminating inflammation.Lipopolysaccharide（LPS）intervening macrophage inflammatory cell model was established，and the anti-inflammatory activity of extracted wheat germ globulin was studied in vitro.The cytotoxicity of wheat germ globulin on RAW264.7 cells was examined through cell culturation in vitro.The influence of wheat germ globulin on the NO production before and after RAW264.7 cells induced by LPS were studied by Griess method，while the content of cytokines TNF-α in inflammatory cell model was detected by ELISA method.The results showed wheat germ globulin had significant anti-inflammatory ability，and was non-toxic on RAW264.7 cells；wheat germ globulin could significantly promote the NO production of normal RAW264.7；the different concentrations of wheat germ globulin could significantly inhibit the NO production of RAW264.7 cell induced LPS，and the inhibitory effect was increased in dose manner; wheat germ globulin also had significantly inhibition effect on proinflammatory factor TNF-α.It was concluded thatwheatgerm globulin had anti-inflammation effecton theassociated diseasesofpro-inflammatory inflammatory.The present study will provide supplyment for the development of the functional health food and raw materials of anti-inflammatory drugs.

THE ANTI-INFLAMMATORY FUNCTION OF WHEAT GERM GLOBULIN IN VITRO

BI Zhenyuan1，HUANG Jihong1，2，LIU Na1，FENG Junwei1，JI Xiaoguo1，LI Haiyue1，ZHAO Yi1，ZHANG Yaqi1
（1.School of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Food Industry Research Institute of Henan Province，Zhengzhou 450000，China；）

wheat germ globulin；RAW264.7 cell；macrophage inflammatory cell model；anti-Inflammatory

Q26

B

1673-2383(2017)02-0063-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170420.1409.022.html

2016-08-24

河南工业大学谷物资源转化与利用省级重点实验室开放课题（001254）；河南省国际科技合作与交流项目（152102410032）；郑州市国际科技合作与交流项目（141PGJHZ546）

毕振原（1990—），男，河南商丘人，硕士研究生，研究方向为微生物与生化药学。

*通信作者