基于1H NMR的大米淀粉与马铃薯淀粉水合过程的水状态及分布差异研究

高艺书 , 范大明* , 王丽云 , 沈慧杰 , 陈妍方 , 连慧章 ,赵建新 , 张灏 , 陈卫

1(江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室,江苏 无锡，214122)2(无锡华顺民生食品有限公司，江苏 无锡，214218)

基于1H NMR的大米淀粉与马铃薯淀粉水合过程的水状态及分布差异研究

高艺书1, 范大明1*, 王丽云1, 沈慧杰1, 陈妍方1, 连慧章2,赵建新1, 张灏1, 陈卫1

1(江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室,江苏 无锡，214122)2(无锡华顺民生食品有限公司，江苏 无锡，214218)

淀粉的水合过程显著影响淀粉食品的品质，尤其在中低水分区域，促进了淀粉类食品的多样性。该文聚焦谷类和薯类淀粉的代表：大米淀粉和马铃薯淀粉，利用1H低场核磁共振技术(LF-NMR)研究水分活度在0.2到1.0的大米淀粉和马铃薯淀粉的水分微观分布和流动情况，并比对差异产生的原因。通过采用反转恢复序列IR和利用自由感应衰减序列FID和多脉冲回波序列CPMG两种测试方法，获得2种淀粉体系的纵向质子弛豫(T1)和横向质子弛豫(T2)特征数据。纵向弛豫的研究结果表明，2种水合淀粉的氢质子分别处于2种不同的环境；横向弛豫的研究结果表明，水合大米淀粉中存在2个氢质子类群，而水合马铃薯淀粉则出现2～4个不同的质子类群。由于两者在粒径和溶胀能力上存在差异，故水合马铃薯淀粉较水合大米淀粉表现出更大的质子自由度和更多的质子量。

大米淀粉；马铃薯淀粉；纵向弛豫；横向弛豫

淀粉是非常重要的植物多糖，可以为半固态食品提供胶凝性；同时，又可以作为复杂的碳水化合物来源[1]。多年来，众多学者已经利用各种显微技术和散射技术(光学和电子显微镜，光、X射线以及中子散射等)对天然淀粉颗粒的结构进行了细致研究。然而，针对淀粉颗粒中水分的分布及动态流动情况的研究则有待深入，因为淀粉的物理特性和结构特性与水分子的相互作用强烈相关，水分会显著影响淀粉在直接加热、微波、高压或化学处理等加工过程中所发生的反应。

核磁共振技术是研究淀粉颗粒水状态的一个主流选择，BROSIO, CONTI, LINTAS和SYKORA在1978年首次发表文章，阐述了利用1H 核磁共振技术以研究淀粉质食品中水分含量的可能[2]。根据分辨率的不同，核磁共振分为低场核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)及高场核磁共振(high field nuclear magnetic resonance，HF-NMR)。1H LF-NMR主要通过对纵向弛豫时间T1和横向弛豫时间T2的测量，反应出质子(1H)的运动性质[3]。纵向弛豫时间是指受激发的自旋质子与周围晶格进行能量交换后达到动态平衡所需的时间。它反映了自旋质子与环境的能量关系，以及自旋质子所处系统的状态。横向弛豫时间是指激发态的自旋-自旋质子在与周围质子进行能量交换后达到动态平衡后所需的时间，它能够剔除周围磁场不均一性所带来的影响[4]。目前，尽管已有学者利用1H LF-NMR技术研究淀粉颗粒在糊化过程中水分的变化[5]，但研究淀粉水合过程中氢质子分布的研究还未见报道。

本研究基于大米淀粉和马铃薯淀粉物化特性的差异，利用低场核磁共振技术(1H LF-NMR)对水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系进行检测，对其纵向弛豫和横向驰豫反演数据进行分析。在对检测结果变化规律探讨的基础上，进一步分析其与水分活度的相关性，明确水分活度与淀粉内部水分分布和水分流动状态之间的关系,同时对比种属不同的2种水合淀粉在水分布上的差异，扩大低场核磁共振检测技术的适用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米淀粉[水分含量(9.03±0.01)%，蛋白质含量(0.46±0.04)%，淀粉含量(97.18±0.45)%，直链淀粉含量15.33%，粒径(7.43±0.45)μm]，江西金农生物科技有限公司；马铃薯淀粉[水分含量9.11%，蛋白质含量(0.23±0.02)%，淀粉含量(94.22±0.23)%，直链淀粉含量(13.62±0.31)%，粒径(38.55±2.48)μm]，法国罗盖特公司；六水合氯化镁(分析纯)，KCO3(分析纯)，NaBr(分析纯)，六水合氯化钴(分析纯)，NaCO3(分析纯)，NaCl(分析纯)，KCl(分析纯)，BaCl2(分析纯)，KNO3(分析纯)，蒸馏水以及白凡士林，国药集团化学试剂有限公司；Parafilm® M封口膜，美国BEMIS公司。

1.2 仪器与设备

台式水份活度仪，瑞士罗卓尼克；NMI20型低场核磁共振分析仪，上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系的制备[6]

于培养皿(15 mm)中分别称取一定质量的大米淀粉和马铃薯淀粉，振动培养皿，使淀粉在培养皿中分布均匀，保持淀粉厚度为3 mm。将盛有大米淀粉和马铃薯淀粉的培养皿，依次放置于分别盛有1L由蒸馏水配制的2.1中所述的不同盐类的饱和溶液的玻璃干燥器内。利用白凡士林和封口膜对玻璃干燥器进行密封。恒湿2周，直到样品的水分活度达到平衡状态。

1.3.2 水合淀粉体系水分活度的测定[7-8]

在大米淀粉和马铃薯淀粉恒湿的过程中，每隔一天，利用台式水分活度仪对其水分活度进行测定。针对每一个样品，取样后平行测定3次，取其平均值，作为该样品的水分活度值。恒湿约2周时，淀粉样品的水分活度值达到平衡状态，即相邻两次测定所得水分活度平均值不变(±0.003)，恒湿过程结束，记录最后1次测定所得的平均值，作为淀粉样品的水分活度值。

具体的测定方法为：取一定质量的淀粉于样品杯中，振动样品杯，使得淀粉在样品杯中分布均匀，保证淀粉覆盖样品杯底部，淀粉样品厚度为5 mm，将盛有淀粉的样品杯置于台式水分活度仪的测量舱内，将水活性探头置于测量舱上，测定开始。待显示屏上水分活度数值稳定，不再波动后，进行读数。

1.2.31H LF-NMR测定纵向弛豫时间(T1)和横向弛豫时间(T2)

利用一台磁场强度为0.52 T和质子共振频率为21.96 MHz的低场核磁共振分析仪测定弛豫时间。平衡的样品被放置于外径为15 mm的低场核磁共振管中。管口利用封口膜密封，以防止水分流失。各淀粉样品分别进行15次平行测试，并记录每个样品管中样品的准确质量(g)。利用CONTIN算法对测试结果进行反演[9]，以获得具有连续弛豫时间分布的弛豫曲线。T1和T2弛豫时间代表了相应质子类群中所有质子的平均自由度。每一质子类群曲线下的峰面积与这一质子类群中的氢质子数成正比。

1.3.3.1 T1的测定[5]

使用反转恢复脉冲序列，即IR序列来测定纵向弛豫时间T1。实验参数设置如下：反转时间(TI)为600 ms，等待时间(TW)为2 s，每一次测试重复进行16次扫描。

1.3.3.2T2的测定[10]

采用90°单脉冲自由感应衰减序列，即FID序列和多脉冲回波序列Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)进行横向弛豫时间T2的采集。在硬脉冲界面调准中心频率(淀粉中氢质子的共振频率)，然后设置90°和180°脉宽， 90°脉冲时间P90为7.2 μs，180°脉冲时间P180为15.2 μs。对于FID信号，采样间隔为0.5 ms，采样点数为500，累计扫描次数为128；对于CPMG序列测试，半回波时间τ值=200 μs，采样点数TD=4 036，回波数EchoCount=400，累加扫描次数NS=128，两次扫描之间的重复时间TR=600 ms，模拟增益RG1=20，数字增益RG2=3。

2 结果与分析

2.1 水合淀粉体系的水分活度

表1列出了水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系的水分活度，由表可知，2种淀粉体系的水分活度是呈现梯度上升的趋势的。

表1 水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系的水分活度

表2 水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系的纵向弛豫时间T1及峰面积

注：表格中所有数据均是以15个平行数据的平均值形式列出的。数据右侧标有不同字母表示同列组别间具有显著差异(P≤0.05)。

2.2 纵向弛豫时间(T1)的变化

T1弛豫时间是指受激发的自旋质子与周围晶格进行能量交换后达到动态平衡所需的时间。它反映了自旋质子与环境的能量关系，以及自旋质子所处系统的状态。T1反演谱表明了特定氢质子类群的纵向弛豫时间(T1，i)和其相对含水量(mT1，i)。图1a，图1b分别展示了水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系的纵向弛豫时间T1随水分活度的分布变化。2种淀粉体系均表现出2个不同的峰，这表明，每一种水分活度的淀粉样品中均存在处于2种不同环境中的氢质子。从谱线的变化规律上看，第一个峰随着水分活度的不断增加，明显逐渐向右移动，即T11逐渐增大；而第二个峰的峰位随水分活度增加的变化并无明显规律。

图1 水合大米淀粉体系(a)和水合马铃薯淀粉体系(b)的纵向弛豫谱图Fig.1 Longitudinal relaxation of hydrated rice starch system (a) and potato starch system(b)

为了更好的分析2种水合淀粉体系的水分分布与水分活度的关系，研究将具体的纵向弛豫参数数据提取到表2中。数据表2表明，水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系的T11分别分布在相对较短的时间区间，既从2.23 ms变化到5.07 ms，以及从2.30 ms变化到 11.17 ms。这部分的氢质子被周围的淀粉所限制，形成氢键，导致其具有较快的自旋-晶格弛豫以及较短的T11。此外，根据图1和表1可知，2种水合淀粉体系水分活度的增加，均引起其T11的整体增大。这种现象可以解释如下，随着水分活度的不断增加，由于水的增塑作用，这部分氢质子受到的束缚作用逐渐减弱，其自由度逐渐增加。对2种水合淀粉体系的T11结果进行线性回归拟合，分别得到拟合方程y=4.9123x+0.9158，R2=0.957，以及y=14.361x-2.1877，R2=0.968，表明随着水分活度的增加，T11逐渐增大，并呈现一定的线性相关，见图2。

图2 水合大米淀粉体系(a)和水合马铃薯淀粉体系(b)的T11与水分活度的相关性Fig.2 Correlation between T11 and water activity of hydrated rice starch system (a) and potato starch system (b)

对比2种水合淀粉体系T11的变化范围可以发现，水合马铃薯淀粉体系的T11相对较大，如水分活度同为0.5的2种淀粉样品，马铃薯淀粉的T11为6.06 ms，明显大于大米淀粉的4.01 ms，两者在T11上的差别，可能是由于粒径上的差异，由于大米淀粉的粒径相较于马铃薯淀粉较小，形成氢键的可能性更高，结合力更大，对氢质子的束缚作用也越强，所以表现出的T11更小。至于T12，显示在表1的数据结果表明，水合大米淀粉体系和水合马铃薯淀粉体系的T12均在相对较长的时间区域内分布，分别为67.11 ms至78.67 ms，75.65 ms至86.97 ms。这部分氢质子受到的束缚作用较小，可能处于淀粉颗粒的外部环境，同时，这部分氢质子的T12并没有按照水分活度的梯度增加呈现一定的规律性变化。另外，从氢质子的量上来看，对于2种水合淀粉体系而言，mT11和mT12都随着水分活度的增加，逐渐变大，这一点比较容易理解，原因是随着水分活度的不断增加，水合淀粉样品中的水分含量也在不断增加，相应的检测到的2种质子类群中的氢质子也在不断增加[11]。对比2种淀粉体系的mT11和mT12可以发现，同一水分活度值时，水合马铃薯淀粉的值更大，原因是马铃薯淀粉具有更强的溶胀能力，可以吸收更多的水分[11]。

2.3 横向弛豫时间(T2)的变化

为进一步了解水合淀粉体系中氢质子的分布和流动状态，研究利用FID序列和CPMG序列来测试样品的T2。T2是指激发态的自旋-自旋质子在与周围质子进行能量交换后达到动态平衡后所需的时间，它能够剔除周围磁场不均一性所带来的影响[4]。

表3列出了2种水合淀粉体系的T2以及相应质子类群的峰面积。观察表3可以发现，通过FID序列检测，2种水合淀粉体系均出现一个质子类群，而利用CPMG序列测试所得结果则有明显区别，水合大米淀粉仅出现一个质子类群，而水合马铃薯淀粉则出现1～3种质子类群。出现这种现象的原因是由于横向弛豫受扩散效应的影响，当样品中2个独立区域间的氢质子扩散交换速率比它们本身的弛豫速率大时，1H NMR则无法分辨开来[12]。这样的实验结果与TANG等的研究结果类似[13]，即针对A型淀粉，如大米淀粉，1H NMR由于识别能力有限，只能识别检测到一个单峰，而针对B型淀粉，如马铃薯淀粉，则可以检测识别到3个峰。原因可能推断为，大米淀粉由于粒径相对较小，导致其颗粒内部水分化学交换的速率超过了谱仪可以识别的最低检测限度，最终使得淀粉颗粒内不同区域内氢质子间的差异变得模糊。

由于水合马铃薯淀粉通过测试出现了更多的氢质子类群，故接下来先分析水合马铃薯淀粉的水分布及状态。水分活度在0.288～0.574的马铃薯淀粉，只存在一个窄的FID峰和一个宽的CPMG峰，即质子类群A和质子类群CD。基于之前学者针对淀粉模型体系的1H NMR研究结果，本研究认为质子类群A中的质子是处于淀粉结晶结构或刚性无定型结构中的CH基团的氢质子，其并不与水分发生相互作用，因此具有非常小的T2值，约10 μs。类群CD中的质子具有相对较高的自由度，T2值约为0.4～2.1 ms，它们是无定形淀粉结构中流动性更强的CH基团的氢质子，以及处于淀粉颗粒内部，可以在淀粉和水之间进行化学交换的OH基团的氢质子[14]。当水分活度增加到0.678时，自由度较低的质子类群C，弛豫时间为0.3～0.4 ms，峰面积较小，可认为这部分氢质子是无定形淀粉中，可以与水发生相互作用的CH基团中的氢质子。而自由度较大，弛豫时间为3.9 ms的质子类群D则包含了淀粉颗粒内部，可以在淀粉与水之间发生化学交换的OH基团的氢质子。质子类群D的峰面积较水分活度为0.288～0.574的样品均更大，这是由于额外增加的水质子的影响。当水分活度继续增大时，质子类群A的峰面积继续下降，同时出现了弛豫时间更大的质子类群E，T2值约为9～19 ms，其包含处于淀粉颗粒外部的水OH基团的氢质子，可以在淀粉颗粒的外表面与淀粉OH基团发生化学交换。因此，类群E代表了一个独立且更自由的淀粉颗粒外部空间[14]。当水分活度达到一定值时，淀粉颗粒表面可以起到结构屏障的作用，阻碍颗粒内外环境间的扩散[13]。质子类群E被区分出来，表明只有在一定的水分活度时，质子类群间的平均自由度差异才足够大，以至于可以被仪器检测出来。

对于水合大米淀粉体系而言，所有水分活度的样品，与水分活度处于0.291～0.591的水合马铃薯淀粉样品类似，全部都仅存在质子类群A和质子类群CD。质子类群A中的质子是处于淀粉结晶结构或刚性无定型结构中的CH基团中的氢质子。而类群CD的情况比较复杂，其弛豫时间的变化范围较大，约为0.2～3.3 ms，这部分氢质子可分为3种类型，即无定形淀粉结构中CH基团中的氢质子；处于淀粉颗粒内部，可以在淀粉和水之间进行化学交换的OH基团中的氢质子；以及处于淀粉颗粒外部的水OH基团中的氢质子。

总的来看2种水合淀粉体系，随着水分活度的不断增加，质子类群A的横向弛豫时间逐渐增大，且对应的峰面积逐渐减小。最有可能的原因是，部分无定形区域中刚性的CH基团的氢质子受到水分增塑作用的影响，导致自由度增加，成为质子类群CD的一部分。而大米淀粉由于自身粒径较小，结构较致密的影响，并没有像马铃薯淀粉一样，在检测中出现不同质子类群分离的现象，这种变化仅体现在类群CD的弛豫时间不断增加上。质子类群CD的范围较宽，包含有淀粉颗粒内部的氢质子，针对水合马铃薯淀粉样品，其弛豫时间覆盖了水分活度较高的样品的质子类群D，当水分活度增大时，尽管质子类群D中的氢质子仍处于淀粉颗粒内部，但是其分辨率却提高了，可以被仪器识别出来。水合马铃薯淀粉的质子类群CD，D的峰面积与T2值均比相应水分活度的水合大米淀粉的质子类群CD大，原因可能是两者存在溶胀能力和平均粒径方面的差异，马铃薯淀粉溶胀能力较强，可以吸收更多的水分，同时，相对更大的粒径使其具有更大的颗粒内环境，进而使得其峰面积和质子自由度均较大。

表3 水合大米淀粉和水合马铃薯淀粉横向弛豫时间T2和峰面积

注：FID序列测试获得质子类群A，CPMG序列测试获得质子类群C,CD,E；表格中所有数据均是15个平行数据的平均值。数据右侧标有不同字母表示同列组别间具有显著差异(P≤0.05)。RS代表大米淀粉，PS代表马铃薯淀粉，RS/PS-X代表不同水分活度的大米淀粉或马铃薯淀粉样品。

3 结论

1H低场核磁共振技术可以很好地用来研究水合大米淀粉和马铃薯淀粉的水分分布及流动性。2种水合淀粉在氢质子分布上存在一定的差异，即水合大米淀粉的氢质子较水合马铃薯淀粉在自由度上受水分活度的影响较小，仅出现2个质子类群，原因可能是两者在平均粒径和溶胀能力上存在显著差异。

由于大米淀粉和马铃薯淀粉在食品加工领域具有一定的相关性[15-17]，故接下来的研究，可以以本文的结论为依据和参考，进一步利用核磁共振技术，探讨谷类淀粉与薯类淀粉在不同的加工处理过程中结构与功能上的联系，例如，研究2种淀粉在微波加热处理后与糊化特性相关的氢质子分布上的变化。

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1H NMR study on the difference in water status and distribution between rice starch and potato starch during hydration process

GAO Yi-shu1, FAN Da-ming1 *, WANG Li-yun1, SHEN Hui-jie1,CHEN Yan-fang1, LIAN Hui-zhang2, ZHAO Jian-xin1, ZHANG Hao1, CHEN Wei1

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Wuxi Huashun Minsheng Food Co. Ltd., Wuxi 214218, China)

The hydration process of starch significantly affected the quality of food, especially in the area with middle and low water content, which provide the diversity of starch food. In this paper, rice starch and potato starch, the representative starch from grain were chosen as the subjects. The proton distributions of hydrated rice starch and potato starch with water activity from 0.2 to 1.0, were investigated by1H LF-NMR to find differences. The longitudinal and transverse proton relaxation (T1andT2) of the two starch systems was obtained by using the inversion recovery sequence IR, and the free induction decay sequence FID and the multi-pulse echo sequence CPMG. The results showed that, through the detection of longitudinal relaxation, 2 different populations were found in the two hydrated starch systems. Through the detection of transverse relaxation, 2 populations were distinguished in the hydrated rice starches, while 2-4 different populations were detected in the hydrated potato starches. Due to the difference in particle size and swelling capacity, hydrated potato starches showed greater proton freedom and more proton quantity than hydrated rice starches.

rice starch; potato starch; longitudinal relaxation；transverse relaxation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705016

硕士研究生(范大明副教授为通讯作者，E-mail：fandm@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金(31301504, 31571879)；十二五国家科技支撑项目(2014BAD04B03)；高等教育研究基金博士项目(20130093120011)

2016-09-26，改回日期：2016-10-08