酱香型大曲细菌的多样性

王晓丹，雷安亮，班世栋，邱树毅*

1(贵州大学，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳，550025)2(贵州珍酒酿酒有限责任公司，贵州 遵义，563003)3(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳，550025)

酱香型大曲细菌的多样性

王晓丹1，3，雷安亮2，班世栋1，邱树毅1，3*

1(贵州大学，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳，550025)2(贵州珍酒酿酒有限责任公司，贵州 遵义，563003)3(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳，550025)

以酱香型大曲为研究对象，研究酱香型大曲细菌种群多样性及功能基因预测。分别采用可培养稀释平板法以及高通量测序方法分析大曲细菌群落组成，并结合功能基因筛选及高通量测序分析等宏基因组学研究手段，预测其相关基因功能。大曲细菌总数范围在106～108CFU/g，可培养法分离到的51株Bacillussp.，1株Acinetobactersp.。确定酱香型大曲细菌的主体类群组成为以厚壁菌门(87.3%～91.8%)为主要类群，其次是放线菌门(3.3%～9.1%)，并发现了未曾报道过的蓝细菌门Cyanobacteria(0.1%～1.5%)。确定了以Thermoactinomycessp.和Bacillussp.为主的酱香型大曲细菌群落结构组成，其相对含量占细菌总量的60%以上。通过第二代高通量测序方法还对大曲样品中细菌的代谢功能基因进行了预测。

酱香型大曲；高通量测序；细菌多样性；功能基因预测

白酒大曲的制作在中国已有2000多年的历史，制曲过程中，经40 d发酵，逐渐形成了以细菌、霉菌和酵母菌为主的群落结构，其中，细菌尤其是耐高温细菌的数量最多。目前对酱香大曲中细菌种类和功能的研究主要采用2种方式进行，一是用传统可培养方法从大曲中分离细菌，通过形态特征和生理生化试验鉴定细菌，一些研究表明，Bacillussp.是大曲中的优势菌，有很强的耐热能力，在发酵体系中能够生产大量高温型淀粉酶，促进大曲原料的降解[1]，同时能够代谢产生多种游离氨基酸，经过发酵体系美拉德反应，产生酱香风味[2-3]；二是用新一代免培养技术研究大曲细菌群落结构，采用PCR-DGGE免培养技术研究大曲贮藏时的群落结构，得出了与传统可培养法类似的结果，并检测到了可培养法中没有检出的菌种[4-5]，更全面地分析了大曲中的细菌的群落特征。酱香型大曲研究一般只研究酱香型大曲制曲时微生物的动态变化，但是成品曲使用前还需要6个月的储藏，以降低大曲的酸度和邪杂味，同时此过程又网罗了环境中微生物，细菌群落结构又发生变化[6]，因此，结合大曲的制作工艺和酱香型白酒的制酒工艺，以白酒生产时所用的曲粉作为研究对象，更能准确解析酱香型大曲中细菌的类群结构及功能，从而为今后更加深入地研究细菌在酱香白酒风味形成中的作用提供有意义的指导。

采用传统茅台高温制曲工艺，选取贵州遵义地区的3个企业的生产用曲，通过可培养法和第二代高通量测序方法分析大曲中细菌群落组成，并基于宏基因组学技术，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，预测酱香型大曲细菌的功能基因，将有助于揭示大曲特征性细菌群落与优质酱香白酒品质之间的重要关系。

1 材料和方法

1.1 材料

酱香型大曲制作以优质小麦为原料，加水润粮3h左右，磨碎，加入5%～10%的曲母，37%～40%的水，搅拌均匀；加入曲模，脚踩成型，放置2 h后入曲房发酵40 d，在前14 d，每7 d翻曲1次，发酵结束后在曲仓储藏3～6个月，粉碎后与高粱混合酿酒。研究共采集3种酱香型大曲MT01、ZJ01、ZX01。

1.2 细菌的分离鉴定

1.2.1 细菌的形态学鉴定

取样品10 g，90 mL已灭菌的生理盐水，于35 ℃，120 r/min摇床振荡30 min。稀释到合适的浓度梯度，并进行菌落计数。取菌悬液0.2 mL涂布于营养琼脂培养基上， 35 ℃培养1 d，观察菌落形态。挑选出不同的菌落形态进行平板划线，分离出单菌落。接种单菌落观察菌落形态，并用革兰氏染色法在光学显微镜(江南永新光学(南京)有限公司)下观察菌落形态特征。

1.2.2 生理生化鉴定

对细菌分别进行糖发酵试验、柠檬酸盐试验、V-P试验、接触酶试验、淀粉水解试验、厌氧生长、吲哚试验等生理生化试验(《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》及《一般细菌常用鉴定方法》)。

1.2.3 分子生物学鉴定

取LB培养基37 ℃培养1 d菌液1 mL于1.5 mL离心管中，8 000 r/min离心3 min，弃上清；按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA。扩增细菌16S rDNA序列，扩增引物为27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′)，和1492r (5′-GGT-TACCTTGTTACGAC TT-3′)。在25.0 μL PCR反应体系下，2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技(北京)有限公司)12.5 μL，0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环，72 ℃保持10 min。取2 μL电泳，PCR产物经琼脂糖电泳确定目的条带后，利用凝胶回收试剂盒切胶回收DNA(宝生物工程(大连)有限公司)，并电泳检测。PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序完成，将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上Blast比对鉴定。

1.3 高通量测序方法

取大曲0.25 g，按照Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)试剂盒提取DNA。扩增细菌16S V3～V5区，选择F (5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3) 和R (5-CCGTCAATTCMTTT

1.4 数据分析

高通量测序建库过程中的PCR扩增会产生嵌合体序列(chimera sequence)，测序过程中会产生点突变等测序错误，为了保证分析结果的准确性，需要对有效序列进行进一步过滤和去除嵌合体处理，得到最终用于后续分析的优质序列。运用mothur软件(version 1.31.2，http://www.mothur.org/)中uchime的方法去除嵌合体序列，标准如下：去除5’端引物错配碱基数> 1的序列；去除含有N(模糊碱基)的序列；去除含有连续相同碱基数>8的序列；去除长度≤150 bp的序列。对这些优质序列依据序列相似性，用软件Qiime调用uclust对所有样品的优质序列按0.97的相似度进行聚类，将序列归为1个操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，去除无法分类的OTU，选取每一类中最长的序列作为OTU的代表序列。采用Blast的方法在Green gene经每个分类水平注释发现，在属水平，注释的序列最多，所以数据在属水平分析。根据NCBI信息数据库，将测序得到的物种丰度信息回归至数据库分类学系统关系树中，从整个分类系统上全面了解样品中所有微生物的进化关系和丰度差异。在本研究中，取丰度前100位的OTU表信息，应用软件MEGAN 4[7-8]进行功能基因的预测和相关统计分析。

2 结果和讨论

2.1 酱香型大曲细菌群落组成

2.1.1 可培养方法解析酱香型大曲细菌群落组成

采用可培养方法，测定样品中细菌总数大小顺序为：ZJ01(1.85×108cfu/g)>MT01(3.6×107cfu/g)>ZX01(3.8×106cfu/g)，细菌作为大曲三大微生物类群之一，在酿造过程中呈现出种类多、功能多的特点，是发酵生香的动力来源[9]，细菌多样性和丰富度高的大曲具有更高的发酵品质，对出产白酒良好风味特征的形成造成重要影响。

共分离鉴定出的5种细菌，4种为Bacillussp.，1种为Acinetobactersp.，在MT01、ZX01、以及ZJ01大曲中的含量分别为29.70%、7.00%、48.10%和0.20%、0.10%、0.20%。其中Bacilluslicheniformis和Bacillusamyloliquefaciens在大曲中含量都比其他细菌多，是典型的嗜热芽孢杆菌，也是大曲中产酱香功能细菌，在发酵体系中能产生大量淀粉酶以及蛋白酶[10-12]。在贵州遵义地区酱香大曲制曲过程中发现以厚壁菌门为主的49个细菌属，其中以Thermoactinomycessp.和Bacillussp.为优势菌种，初步推测为地域性微生物类群[13-14]；在福建省福矛窖酒高温大曲中同样分离到Bacillussp.[15]；在浓香型大曲[16-17]同样也发现了数量占优的Bacilluslicheniformis等产香芽孢杆菌。Acinetobacterbaumannii又被称为鲍曼不动杆菌，为医院感染的重要的条件致病菌，具有天然和获得性耐药能力[18]，目前还没有其在白酒领域的研究报道。

可培养法可以分离得到单菌株，从而探究菌种的功能并应用于实际的工业生产，但在不确定大曲菌群结构的情况下，采用常用的分离培养基，故难以全面地分析大曲中细菌的种群结构[19]。本研究中可培养法的鉴定结果只能检出得细菌两个属，分析结果不够全面，可能与采用未优化的培养基进行分离筛选有较大的关系。

表1 可培养细菌种类

注：表1中的数据代表菌株的数量，“-”表示没有该菌株。

2.1.2 免培养的方法

采用454 FLX+平台高通量测序技术对样品细菌种群进行分析，得到在各分类水平上(门、纲、目、科、属)的物种组成比例以及群落结构情况。细菌类群分析平均92%以上的序列可以注释在科水平。有70%的序列可以注释到属的水平，16类细菌没能注释到属。许多细菌均不能注释到种的水平，5类的细菌只能注释到目，说明该方法仍有缺陷。确定酱香型大曲细菌的主体类群组成为以厚壁菌门为主要类群，其次是放线菌门，芽孢杆菌目占细菌总数的一半以上。芽孢杆菌科Bacillaceae和高温放线菌科Thermoactinomycetaceae是酱香型大曲细菌的优势种类。最终确定Actinopolysporaceae, Bacillaceae, Brevibacteriaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae, Streptomycetaceae, Thermoactinomycetaceae, Moraxellaceae, Pseudonocardiaceae, 和Planococcaceae.是酱香型大曲的细菌的科水平下类群结构。

根据OUT聚类结果，在属的层次下进行分析3个样品中共有的14个细菌类群，这与酱香大曲的制曲生产工艺有着密不可分的联系[13-14]，这些细菌属是酱香大曲的主要类群构成，其中的Thermoactinomycesp.、Bacillussp.[13]、Lactobacillussp.、Acetobactersp.[20]等菌属经证实对酱香型白酒风味品质的形成有重要贡献。

如图1所示，MT01中有4个属相对含量大于1%，相对含量均匀，主要以Firmicutes门(厚壁菌门)为主，占大曲细菌总量的81.0%，是主要细菌种属；ZX01中有6个属相对含量大于1%，Thermoactinomycessp.超过总量的50%，其代谢功能对大曲品质的影响很大；ZJ01中有4个属相对含量大于1%，Bacillussp.的相对含量与MT01相近，Thermoactinomycessp.含量略高于MT01低于ZX01。

图1 三种酱香型大曲MT01、ZX01、ZJ01细菌种群比例图Fig1 Scale map of bacterial population in three kinds of Maotai-flavor Daqu: MT01, ZX01, ZJ01注：未注释到属的细菌分别在MT01,ZX01和ZJ01占细菌总数的15.70%, 16.6%、10.70%。未被检测的序列在3个样本的比例分别为0.00%, 0.10%和0.20%。

采用可培养方法分析大曲中细菌群体主要由Bacillussp.组成，免培养研究发现Thermoactinomycessp.与Bacillussp.为主要优势菌群，在发酵温度超过60 ℃的高温制曲中，Thermoactinomycessp.数量高于Bacillussp.，这表明在酱香型大曲中同样扮演了重要的角色。刘洋、姚粟等从山东扳倒井芝麻香型高温大曲中分离得到1株Zm60菌株，经鉴定属于Thermoactinomycesvulgaris，确定其具有碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性，在芝麻香型白酒风味的形成中具有不可忽视的作用[21]。这也说明该菌属在酱香大曲中是否具有类似功能就值得进行深入研究。酱香型大曲中的细菌种类繁多，主体类群结构相似。温度为高温大曲细菌群落形成的重要因素，通过40 d的固态发酵，从45 ℃升温期到65 ℃高温期再回落到45 ℃的降温期，大曲细菌类群均呈现一定程度的增长，成熟期品温接近环境温度时，细菌总量趋于稳定[22]，以嗜热性Thermoactinomycessp.、Bacillussp.为主的细菌特征性种群结构基本形成。

因此，通过本研究发现，在研究白酒酿造微生物的细菌类群结构时，可以先通过高通量测序技术对样品的细菌组成有明确的了解，再根据这一结论设计不同的培养方法，获得可培养的细菌，进一步研究其在大曲中的功能。

此外，在免培养分析过程中也发现，使用16S细菌和古菌数据库：RDP、Silva、Greengene进行比对，40%的细菌均不能注释到种的水平，有含量高达16%的16类细菌没能注释到属，5类细菌只能注释到目，说明该方法仍有缺陷。

2.2 大曲细菌功能多样性预测

通过第二代高通量测序方法不仅能分析细菌的类群组成，还可以以序列分析为主，采用与已知功能基因进行序列比对的方式来预测酱香大曲样品中细菌群落的功能基因组成，并绘制功能基因柱状图反映菌种功能基因的种类以及其丰度信息。结果见图2。

图2 功能基因的柱状图功能基因的种类及其丰度信息Fig.2 Bar graph of functional genes. Information about species and abundance of functional genes

从功能基因的种类及其丰度信息来看，环境信息处理功能中膜运输是所有功能基因丰度最高的；新陈代谢最为丰富，其中氨基酸代谢与碳水化合物代谢均十分丰富；此外，对遗传信息处理、有机物的合成、细胞过程及信号等方面的功能基因也进行了预测。在这些功能基因中值得关注的是在大曲中的微生物都预测到了萜类代谢、聚酮类化合物、膜转运蛋白等功能，而其中萜类代谢功能大曲中丰度很高，一些研究也表明，萜类尤其是萜烯类物质同样是药香型白酒中一类重要的香气成分，在发酵及陈酿过程中逐渐释放出来[23]，聚酮化合物作为微生物代谢生产的次级代谢产物对菌体细胞的稳定有重要作用[24]，研究的结果无疑暗示着酱香大曲中细菌在这类物质代谢合成上的重要贡献。啤酒微生物功能分析获取了乳杆菌的基因序列及1824个预测基因的功能信息[25]；在人和动物胃肠道微生物类群多样性及功能性探究中，Swanson 对狗粪便微生物的宏基因组进行随机测序分析，发现拟杆菌门Bacteroidetes和厚壁菌门Firmicutes是优势菌群，动物胃肠道中还含有种类和数量丰富的生物质降解酶类[26]；同样在土壤研究领域，贺纪正等[27]采用第二代测序平台进一步探讨不同类型土壤微生物群落的演化特点和驱动因子。

根据上述的预测结果，可以进一步对大曲细菌群落的功能性做出科学推测，在大曲中细菌群落的控制代谢以及信号分子的相互作用功能基因大量存在，这暗示着细菌群落在大曲中必然参与到各种物质代谢的过程之中，是酱香大曲中的关键微生物类群，通过大曲细菌功能多样性的预测，再次证实了酱香大曲中细菌群落在原料降解及风味形成中的重要功能。

3 结论

分别采用可培养方法和免培养技术来分析酱香型白酒大曲中的细菌微生物种群，从物种分类水平上详细描述了酱香型大曲细菌群落的特征性结构，同时通过功能基因组成的预测，证实酱香型大曲中的细菌种群主要具有环境信息处理功能、控制代谢功能以及遗传信息处理功能，加深了对大曲细菌群落的功能性特征的了解，从而为今后大曲细菌多样性及功能性的深入研究提供了新的思路。

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Research on bacterial diversity of Maotai-flavor Daqu

WANG Xiao-dan1，3, LEI An-liang1,2, BAN Shi-dong1, QIU Shu-yi1*

1(Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University, Guiyang 550025,China)2(Guizhou Zhenjiu Co., Ltd.，Zunyi 563003, China)3(School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In this study, we investigated the bacterial diversity and functional genes prediction of the Maotai-flavorDaqusamples. The bacterial diversities in three kinds of Maotai-flavorDaqusamples were analyzed via the dilution-plate method and high-throughput sequencing method. The results showed that the total number of bacteria colonies was in the range of 106-108CFU/g, and a total of 51 strains ofBacillussp. and only 1 strain ofAcinetobactersp. were identified by the dilution-plate method. Meanwhile, Firmicutes (87.3%-91.8%) were demonstrated to be the dominant bacterial phylum in the three Maotai-flavorDaqusamples via the high-throughput sequencing method. Intriguingly, Cyanobacteria (0.1%-1.5%) were firstly identified in this study. Moreover,Thermoactinomycessp. andBacillussp., with the relatively abundances > 60%, were also demonstrated to be the dominant bacterial genera in the three Maotai-flavorDaqusamples. Furthermore, the metabolic functional genes prediction was also investigated via the high-throughput sequencing method.

Maotai-flavorDaqu; high-throughput sequencing; bacterial diversity; functional genes prediction

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705012

博士，副教授(邱树毅教授为通讯作者，E-mail:syqiu@gzu.edu.cn)。

贵州省科技支撑计划项目(黔科合支撑[2016]2340);贵州省工业攻关项目(黔科合GZ字[2014]3012);贵州省重大专项项目(黔科合重大专项字[2015]6012)

2016-11-03，改回日期：2017-01-04