福建古田红曲生产用红曲霉菌主要种类的鉴别

李志强，刘颖，林风，吴丽云

(福建省微生物研究所，福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福建 福州，350007)

福建古田红曲生产用红曲霉菌主要种类的鉴别

李志强，刘颖，林风*，吴丽云*

(福建省微生物研究所，福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福建 福州，350007)

以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的5株红曲霉菌为对照，对福建省微生物研究所红曲霉菌资源库中收藏自福建省古田县的60株红曲霉菌(Monascussp.)进行分类鉴定研究。首先根据不同菌株在麦芽汁琼脂(Wa)、察氏酵母提取物琼脂(CYA)和甘油硝酸盐琼脂(G25N)培养基上的菌落形态特征进行初步分类，进而基于核糖体DNA内转录间隔区(rDNA internal transcribed spacer，rDNA ITS)、核糖体大亚基(28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene，LSU)和核糖体小亚基(18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene, SSU)的基因片段的测序结果，在GenBank中通过BLAST进行分子生物学方面的鉴定研究，并用ITS序列构建系统发育树。通过形态特征及3个基因序列的比对，认为所选取的60株古田红曲霉菌分别归属红色红曲霉菌(M.ruber)、丛毛红曲霉菌(M.pilosus)或紫色红曲霉菌(M.purpureus)3个种。

红曲霉菌；ITS；LSU；SSU；鉴定

红曲霉菌(Monascussp.)为丝状真菌，可用于生产安全的天然色素和食品添加剂[1]。红曲霉菌最有名的产品当属红曲(红曲霉菌发酵过的大米)，在东亚和东南亚国家被广泛用作食品着色剂、鱼肉防腐剂、醋酒发酵剂以及心血管病治疗药[1]。近20多年的研究发现红曲霉菌在代谢中可产生多种次级代谢产物，包括色素、莫纳可林、γ-氨基丁酸、麦角甾醇、多不饱和脂肪酸、黄酮等多个种类的生物活性物质，具有降血脂、降血压、降血糖、抑菌、抗癌和提高免疫力等多种功效[2-3]。现阶段市售的血脂康和脂必妥中的主要成份即来源于红曲。红曲的产地主要分布在我国福建、浙江、广东、台湾等地，其中福建的古田红曲最为著名[4]。

我国对制作红曲所用红曲霉菌的研究于1960年代开始。经过10多年的研究，中国科学院和福建省的相关学者应用传统的微生物分类方法，从红曲产品中发现并鉴定了9个不同的红曲霉菌种类，并从以古田红曲为主来源的150多个生产菌株中选出11株[分别归属红曲红曲霉菌(Monascusanka)和变红红曲霉菌(Monascusserorubescens)]，推向全国用于色素和黄酒的生产[5]。半个世纪以来，古田红曲生产工艺不断得以改进、生产菌种性状不断得以改良、产品类型和质量标准不断得以提升，但生产中使用的红曲霉菌的主要种类是否发生变化，至今未见相关的研究报道。

由于传统分类方法的不足，致使红曲霉菌属种间的分类和命名尚有交叉、存在争议，在一定程度上制约了红曲霉菌的深入研究及更好应用。DNA条形码(DNA barcoding)技术作为一种新兴的物种鉴定方法，以其灵敏、精确、方便和客观的优势，在动植物和真菌中已经得到广泛应用[6]。SCHOCH等提出核糖体DNA内转录间隔区(rDNA internal transcribed spacer，rDNA ITS)可作为真菌界通用的DNA条形码，以利于真菌分类学和生物多样性的研究[7]。如今，大部分实验室都采用ITS作为分子标记进行红曲霉菌的分类鉴定，国内一些学者也已将ITS序列分析用于红曲霉菌的分类鉴定[8-11]。rDNA ITS一般包含两个部分：ITS1和ITS2，5.8S RNA 基因也被包括在ITS之内[6]。但ITS序列较短(真菌的ITS长度一般为650-750 bp)[6]，有时不同种红曲霉菌的ITS序列完全一样[8]，说明在红曲霉菌的分子鉴定中仅仅采用ITS还不能完全满足需要，还需联合其他的分子标记。核糖体大亚基(28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene，LSU)和核糖体小亚基(18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene, SSU)也常被用于真菌的系统发育分析和分子鉴定，并且LSU在一些真菌类群中具有良好的种间区分能力[7]。

本研究从福建省微生物研究所的红曲霉菌种资源库中选取收藏自福建省古田县的60株红曲生产用红曲霉菌，在传统的形态分类基础上，辅以ITS、LSU和SSU基因作为分子标记来进行菌种鉴定，以期阐明现有古田红曲产品中红曲霉菌的主要种类。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

本所红曲霉菌资源库中古田红曲生产用菌株60株(其中40株为原古田红曲厂的生产菌株，20株分离自古田的色曲和酒曲产品)，给予编号M1-M60。前期的研究表明，这些菌株分别具有生产色曲、酒曲和功能红曲的优越特性。购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的5株红曲霉菌，即CICC5018(M.ruber)、CICC5032(M.purpureus)、CICC5034(M.anka)、CICC5044(M.purpureus)和CICC5045(M.pilosus)(分别给予编号M61、M62、M63、M64和M65)，作为本研究对照菌株。

1.2 固体培养基配制及菌落形态观察

麦芽汁琼脂培养基(Wa)：麦芽汁(15°Bx)1 000 mL，琼脂15g。1.0×105kPa 灭菌30 min。

察氏酵母提取物琼脂培养基(CYA)：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KC1 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，酵母提取物5.0 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL。1.0×105kPa 灭菌30 min。

甘油硝酸盐琼脂(G25N)：CYA加25% (质量分数)甘油。1.0×105kPa 灭菌30 min。

采用点接种法接种斜面保藏的菌种于Wa、CYA和G25N培养基上，于25 ℃培养7 d后进行菌落形态观察，包括菌落大小、颜色等[10]。

1.3 菌株的液体培养

液体培养基配制(g/L)：葡萄糖50、蛋白胨15、KH2PO41、NaNO33、酵母粉10、MgSO40.5。加热完全溶化后进行分装，1.0×105kPa 灭菌30 min，冷却备用。

用扁铲从PDA培养基上刮取黄豆大小的红曲霉菌，接入装有新配置液体培养基的三角瓶，置于28℃恒温下培养72h左右，收集菌丝体用于DNA提取。

1.4 DNA提取、PCR扩增和测序

采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，提取流程按照产品说明书进行。

ITS采用引物ITS5 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS4 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)进行扩增；LSU采用LR0R(5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’)和LR5(5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’) 进行扩增；SSU采用NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS4(5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’)进行扩增[7]。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

基因扩增采用50 μL反应体系： 10×PCR反应缓冲液 5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 3 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.75 μL，10 mmol/L的正向引物和反向引物各1 μL，Taq聚合酶(2U/μL) 0.5μL，DNA模板2 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52℃(LSU退火温度为48 ℃)退火30 s，72 ℃延伸90 s，34个循环；72 ℃终末延伸10 min，10 ℃保持。每次反应均设立不含DNA模板的空白对照组。扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳后, 用OMEGA凝胶回收试剂盒(OMEGA Bio-Tek)回收目的片段。纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.5 红曲霉菌的分子生物学鉴定

测序后的基因序列用BioEdit进行拼接，获得所扩增基因的完整序列；采用Clustal X[12]软件对DNA序列进行排序，参数值为默认值，并对排序结果进行手工校正，将5’和3’端的非对位排列区去除。采用ITS序列数据(因为65株红曲霉菌之间的ITS序列差异大于LSU和SSU，见结果与分析)，用MEGA6软件[13]基于Kimura 双参数模型的邻接法(Neighbour-Joining，NJ)构建系统发育树，分析进化关系，自展1000次估计各分支的支持率。从GenBank下载的红曲霉菌属物种的ITS序列为AY498573、AY498574、AY498581、AY498583- AY498586、JF922045和JF922046；以曲霉属的黄曲霉(Aspergillusflavus，DQ683124)、寄生曲霉(A.parasiticus，EF661568)和烟曲霉(A.fumigatus，HQ026746)的3个物种作为外类群。

将所测得的ITS、LSU和SSU序列在GenBank中进行BLAST比对。用MEGA6[13]软件计算GC含量、基于Kimura 双参数模型计算遗传距离。

2 结果与分析

2.1 菌落的形态特征

红曲霉菌在Wa、CYA和G25N培养基上的菌落形态特征在红曲霉菌的分类和鉴定中具有重要的参考价值。本研究发现65株红曲霉菌在相同的培养条件下其菌落形态特征存在差异，在Wa培养基上的菌落形态特征最稳定[10,14]。因此，以Wa培养基上65株红曲霉菌的菌落形态特征作为主要分类鉴定依据，以在另2种培养基上的菌落形态特征作为辅助鉴定依据。形态鉴定结果见表1。

表1 65株红曲霉菌基于菌落形态特征的鉴定结果

根据形态特征，初步可将61株红曲霉菌分别归于红色红曲霉菌、紫色红曲霉菌或丛毛红曲霉菌，其中9株为红色红曲霉菌，38株为紫色红曲霉菌，14株为丛毛红曲霉菌。其余4株依据形态特征无法鉴定到种，需辅以分子生物学方法加以鉴定。

2.2 红曲霉菌的分子生物学鉴定

本研究测定了65株红曲霉菌的ITS、LSU和SSU基因序列，经过排序后的长度分别为581 bp、879 bp和1021 bp，可变位点数分别为2个、1个和1个，简约信息位点数分别为2个、1个和1个。利用本研究获得的ITS基因序列和从GenBank下载的红曲霉菌属和曲霉属物种的ITS序列构建分子系统发育树。基于Kimura 双参数模型进行1 000次自展检验构建的50% 多数一致性NJ树见图1。从图1可以看出，M2、M4、M5、M12-M31、M34-M49、M62-M64与紫色红曲霉菌聚为一支，支持率为81%；M1、M3、M6-M11、M32、M33、M50-M61、M65与红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌聚为一支，支持率为86%。

图1 利用ITS序列基于Kimura 双参数模型构建的50%多数一致性NJ系统发育树Fig.1 50% majority-rule consensus tree resulted from analysis of the ITS sequence data using the Kimura two-parameter model

进一步的序列分析表明，M1、M3、M6- M11、M32、M33、M50-M61、M65的ITS、LSU和SSU基因序列分别相同(组1)，而本研究中其余42株红曲霉菌的ITS、LSU和SSU基因序列分别相同(组2)。BLAST结果显示，组1菌株的ITS与红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌的ITS同一性为100%， LSU与红色红曲霉菌的LSU同一性为100%，SSU与丛毛红曲霉菌和烟色红曲霉菌(M.fuliginosus)的SSU同一性为100%(表2)。由于烟色红曲霉菌在Wa培养基上7天菌落直径为65 mm[14]；而组1红曲霉菌株在Wa培养基上的菌落直径为40～45 mm，因此组1所包含的菌株不应为烟色红曲霉菌，而应为红色红曲霉菌或丛毛红曲霉菌。组2菌株的ITS、LSU及SSU分别与紫色红曲霉菌的ITS、LSU及SSU的同一性均为100%(表2)。

65株红曲霉菌的ITS、LSU和SSU序列的平均遗传距离分别为0.0017、0.0005和0.0004。据形态特征鉴定为红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌的ITS、LSU和SSU的遗传距离均为0。组1红曲霉菌和组2红曲霉菌的ITS、LSU和SSU的遗传距离分别为0.0037、0.0011和0.0010。

综上结果表明：(1)本所保存的M1、M6、M7、M8、M9、M10、M50、M58为红色红曲霉菌，M2、M4、M5、M15- M31、M34-M38、M40-M49为紫色红曲霉菌，M3、M11、M32、M33、M51、M52、M53-M56、M57、M59为丛毛红曲霉菌。以上56株红曲霉菌形态鉴定结果和分子生物学鉴定结果一致。(2)结合基因序列数据后，通过形态数据无法鉴定到种的4株红曲霉菌(M12-M14、M39)均被鉴定为紫色红曲霉菌。(3)从CICC购买的5株红曲霉菌中，4株(M61、M62、M64和M65)的鉴定结果与原分类吻合，只是原归类红色红曲霉菌的M63的形态学特征和3个基因序列的信息与紫色红曲霉菌的一致。

本研究用的60株古田红曲是当今生产广泛使用的红曲霉菌，经鉴定，分别为红色红曲霉菌、紫色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌。该结果与“工业化应用的红曲菌株多为红色红曲霉菌、丛毛红曲霉菌和紫色红曲霉菌”[2]实际情况相符。

3 讨论

红曲霉菌属中种的分类鉴定至今国际上仍未能形成统一的标准，对某些独立的种，仍有异议[14-15,20]；但现阶段，部分研究者认为红曲霉菌属包含9种红曲霉菌[16]。目前红曲霉菌的鉴定主要依赖传统的形态学方法[14]，并辅以生理生化的鉴定方法[10,17-18]。传统的形态和生理生化方法鉴定红曲霉菌是一种重要的方法，但耗时耗力；由于菌落颜色、直径和形状易受培养条件的影响，导致结果不稳定。因此红曲霉菌的鉴定需引入其他方法进行菌种鉴定。

DNA条形码(DNA barcoding)技术作为一新兴的物种鉴定方法在红曲霉菌中也逐渐得到应用。郭芳和李钟庆对白色红曲霉菌、火红色红曲霉菌、烟灰色红曲霉菌和橙色红曲霉菌ITS序列进行了研究，测序结果显示，橙色红曲霉菌与火红色红曲霉菌相同，而白色红曲霉菌与烟灰色红曲霉菌相同，这两组序列仅有2个碱基不同[8]。Lv 等从不同的红曲酒发酵剂中分离出5株红曲霉菌，ITS序列长度均为581 bp，这5株红曲霉菌与紫色红曲霉菌的ITS序列同一性均为100%[9]。杨成龙等以不同来源的41个红曲霉菌为材料，结合ITS序列分析、形态特征及生理生化特征，最终将41株红曲霉菌鉴定为紫色红曲霉菌、丛毛红曲霉菌、橙色红曲霉菌、红色红曲霉菌、烟灰色红曲霉菌和白色红曲霉菌六大类[10]。刘颖等分离出一株功能红曲霉菌菌株NW3-2，其ITS序列与丛毛红曲霉菌、发白红曲霉菌、红色红曲霉菌都只相差1个碱基，与紫色红曲霉菌和橙色红曲霉菌相差2个碱基[11]。Park等首先通过红曲霉菌LSU的D1/D2序列比较阐述了红曲霉菌的系统发育关系[19]。虽然以上研究对不同种的红曲霉菌进行了一定程度的区分，但单独靠一种手段很难将一些特殊的红曲霉菌准确鉴定到具体的种，因此需综合形态学和分子生物学的鉴定手段，相互验证，以获得更加可靠的分析结果。本研究中就有4株仅依据形态特征无法鉴定到种的菌株，结合基因序列数据后鉴定到种。

本研究表明紫色红曲霉菌(CICC5032和CICC5044)和红色红曲霉菌(CICC5034) 的形态特征非常接近，在所选的3个分子标记上均没有差异；Park和Jong的研究也表明这两种红曲霉菌在LSU的D1/D2区域完全相同[19]，这两种红曲霉菌的形态特征也非常相似，因此我们支持Hawksworth和Pitt的观点：M.anka是M.purpureus的同种异名[20]。此外，Hawksworth和Pitt观点，以及Park和Jong的研究结果，都认为M.serorubescens与M.pilosus是同种异名[19-20]。因此，本研究鉴定出的现今古田红曲生产用的主要红曲霉菌种类与中国科学院1970年代推广的11株红曲霉菌主要种类(M.anka和M.serorubescens)大体相符，只是现在用的红曲霉菌中红色红曲霉菌(M.ruber)的比例明显提高。

表2 65株红曲霉菌株ITS、LSU和SSU基因序列的GC含量及BLAST结果

国外学者的研究表明红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌的LSU的D1/D2区域完全相同[19]，ITS和β-tubulin的序列也完全相同[15]。本研究中经形态学初步鉴定为红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌菌株的ITS、LSU和SSU也完全相同。由于红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌在形态特征上具有较明显的差异[19-20]，因此大部分学者认为M.ruber和M.pilosus为两个不同的种。由于这两个种在ITS、LSU、SSU和β-tubulin均没有表现出差异，说明这两个种的亲缘关系非常近，要区分它们，还需借助其他的分子标记才行。本研究在紫色红曲霉菌与红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌的鉴别中，还参考了这些菌株的β-tubulin基因的分析结果(具体数据另文发表)。

ITS是在真菌的分子鉴定中应用最广泛的一个分子标记，2012年时GenBank约有172000条真菌的ITS序列，其中56%的ITS序列具有拉丁名[7]。本研究中紫色红曲霉菌与红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌的遗传距离为0.0037，65条ITS序列的平均遗传距离为0.0017，表明这些菌株的亲缘关系很近。在杨成龙等人的研究中，41株红曲霉菌ITS序列间的平均遗传距离为0.0052[10]，也是很小的。紫色红曲霉菌与红色红曲霉菌和丛毛红曲霉菌的ITS可变位点有2个：1个可变位点位于ITS1，另一个可变位点位于ITS2。ITS1和ITS2均为非编码区域，中度保守，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间具有差异，这也与本研究的结果有较好的一致性。而本研究采用的LSU和SSU，虽然获得的序列长度比ITS长，但变异位点数目均只有1个，少于ITS的2个。这或许与LSU和SSU在蛋白质合成中具有重要的功能有关，其基因序列及二级结构高度保守。

本研究涉及的60株红曲霉菌可谓是福建省古田县当今红曲生产中应用的主要红曲霉菌株，具有广泛的代表性。古田红曲产品中是否还含有红曲霉菌的其他种，我们将继续收集样品进行深入、全面的研究。

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Identification of majorMonascussp. involved in industrial production of Gutian Hongqu

LI Zhi-qiang, LIU Ying, LIN Feng*, WU Li-yun*

(Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products, Fujian Institute of Microbiology, Fuzhou 350007，China)

To characterize and classify major industrial strains ofMonascussp. originated from Gutian Hongqu, we compared 60 strains selected from our institute’s biobank with 5 strains obtained from China Center of Industrial Culture Collection (CICC). The first classification criterion was based upon their colonial morphological characteristics on Wa，CYA and G25N media. Further characterization was performed by comparing the sequences of rDNA internal transcribed spacer (ITS), 28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene (LSU), and 18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene (SSU) of the strains with available sequences in GenBank by BLAST. Neighbor-Joining (NJ) tree was constructed according to the ITS sequences. Based upon the morphological characteristics and the nucleotide sequences comparison, the 60Monascussp. strains were classified asM.ruber,M.pilosusorM.purpureus.

Monascus; rDNA internal transcribed spacer (ITS); 28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene (LSU); 18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene (SSU); identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705011

博士，助理研究员(林风副研究员和吴丽云教授级高级工程师为通讯作者，E-mail：life8810@aliyun.com；lywu66717@163.com)。

福建省公益类科研院所专项(2015R1009-4)；福建省财政厅省直教育科研专项(闽财指[2015]1297号)；福建省公益类科研院所专项(2014R1009-6)；福州市仓山区科技创新公共服务平台项目(2015K03)；福州市仓山区科技计划项目(2015S05)

2016-10-24，改回日期：2017-02-13