pH和阿拉伯胶对大豆分离蛋白/大豆蛋白酶解产物乳化性质的影响

贾聪，华欲飞，陈业明，张彩猛，孔祥珍

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

pH和阿拉伯胶对大豆分离蛋白/大豆蛋白酶解产物乳化性质的影响

贾聪，华欲飞，陈业明，张彩猛，孔祥珍*

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

研究了pH和阿拉伯胶对大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)或低限度酶解改性产物的乳化性质的影响。结果表明：SPI酶解改性处理后制备的乳液颗粒粒径和液滴间絮凝程度明显降低；添加阿拉伯胶促进了SPI或大豆蛋白酶解产物(soy protein hydrolysate，SPH)在油水界面的吸附，SPH-阿拉伯胶复合物制备的乳液在pH4的条件下室温放置14 d具有较好稳定性；添加阿拉伯胶前后，SPH制备的乳液黏度均低于SPI。

大豆分离蛋白；低限度酶解；阿拉伯胶；pH；乳液

大豆蛋白的乳化性质主要是作为浓缩乳液中的加工助剂，例如肉糜乳化剂，而作为乳化剂应用于稀的乳液中非常有限，并且由于大豆蛋白的豆腥味，或可能导致过敏，有一部分人并不喜欢含有大豆蛋白的食品[1-2]。酶解改性在食品体系中是改善蛋白功能性质的一种有效方法，酶解相比于化学处理是一种较为温和的处理方法[3]。酶解会打破蛋白质的三级结构，降低蛋白质的分子量，加强肽段之间的相互作用力以及肽段与外围环境的相互作用力，因此酶解产物的水解程度会影响气水或油水界面性质。值得注意的是，较高的水解度(degree of hydrolysis, DH)会产生大量导致乳化性质下降的自由氨基酸和短链肽，相反的，较低的DH暴露的疏水性和亲水性残基会加强蛋白质两亲性特征，改善乳化性[4]。而大豆蛋白或酶解改性产物乳液的pH在等电点附近容易变得失稳，在酸性条件下较差的乳化稳定性限制了大豆蛋白在食品方面的应用。已有研究发现大豆分离蛋白(soy protein isolate，SPI)经过酶解-糖基化改性后界面张力下降，液滴粒径降低，乳液表现出剪切变稀行为，放置3周后没有乳析层出现[5]。另外，在蛋白体系中添加多糖，通过调节pH使两者带相反的电荷，促使蛋白和多糖通过静电相互作用形成复合物，此复合物用以制备乳液也可以改善稳定性[6-8]。很明显，后者的操作较为温和。本实验对SPI进行低限度酶解改性，研究pH和阿拉伯胶(gum arabic，GA)对SPI和大豆蛋白酶解产物(soy protein hydrolysate，SPH)乳化性质的影响，主要考察乳液液滴粒径、絮凝程度、蛋白和多糖的吸附量、流变性质和乳析指数等指标。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

低温脱脂豆粕：山东禹王集团；阿拉伯胶：Sinopharm化学试剂有限公司;碱性蛋白酶：诺维信(中国)生物技术有限公司；大豆油：无锡欧尚超市；AR级NaOH、HCl：国药集团化学试剂。

1.2 实验仪器

K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器有限公司；磁力搅拌器，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；Himac CR21GⅡ型冷冻离心机，日本HITACHI公司；LGJ-18型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；UV-1500型紫外可见分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司；HH-601超级恒温水浴箱，金坛市精达仪器制造厂；Mastersizer2000型激光粒度分析仪，英国马尔文公司产品；FA25型高速剪切机，上海Fluko 设备有限公司；AH2010高压均质机，上海ATS设备公司；压控流变仪AR1000，英国TA设备公司。

1.3 实验方法与步骤

1.3.1 SPI、SPH和阿拉伯胶储存溶液的制备

SPI的提取采用碱溶酸沉的方法，蛋白质含量为94.58%；酶解产物的制备采用pH-state 方法，水解度为5.0%。将一定浓度的SPI、酶解产物和阿拉伯胶溶液10 000 g离心30 min，除去沉淀取上清，所得上清分别加0.2 g/L叠氮钠，放入-4 ℃冰箱保存。

1.3.2 浊度分析

SPI或酶解产物溶液与阿拉伯胶溶液等体积混合，最终总生物大分子质量浓度为1 g/L。混合溶液逐渐加入0.01～2.0 mol/L的 HCl溶液，pH变化范围2.0～7.0，期间记录pH及相应的浊度值。浊度滴定曲线通过测定样品在600 nm下的吸光度值得到。

1.3.3 乳液的制备

取一定量的SPI或酶解产物溶液分别和阿拉伯胶溶液混合，混合溶液中SPI或酶解产物和阿拉伯胶的质量浓度均为5 g/L,分别调节pH 3.0～5.0，添加大豆油，最终大豆油的质量浓度为100 g/L。用高速剪切机10 000 r/min剪切1 min，然后通过高压均质机40 MPa下均质2次，得到最终乳液。

1.3.4 乳液粒度的测定

采用Mastersizer2000粒度分析仪测定乳状液液滴的粒径大小。乳液的相对折射率为1.107，大豆油和水的折射率分别为1.472和1.330。实验采用d43，即体积平均直径表征液滴粒度的大小。实验中采用去离子水和10 g/L SDS作为分散剂。

(1)

式中：FI，乳液的絮凝率，%；d43和d43SDS，加入去离子水和SDS所测得的体积平均直径，μm。

1.3.5 乳液的界面蛋白和多糖吸附率

蛋白质和多糖在油滴表面的吸附率的测定参照LIANG[9]等的方法测定并略有改动。新鲜制备的乳液在室温条件下10 000 g离心60 min。经离心后，乳液分为上下层，用注射器吸出下部水相，经0.22 μm滤膜过滤后。采用Lowry法和苯酚硫酸法分别测定滤液中的蛋白质和多糖含量。

(2)

式中：AP,蛋白或多糖的吸附率，%；Ci，乳液中总蛋白质或总多糖浓度，g/L;Cs,未吸附的蛋白或多糖浓度,g/L。

1.3.6 乳液流变性质

采用MCR301流变仪测定乳液的流变性质，采用平行板夹具(PP50，直径50 mm，间隙1 mm)，控制温度25 ℃，剪切速率为0～200 s-1。

1.3.7 乳析指数

取新鲜乳液至样品瓶(直径1.8 cm，高度3.5 cm)，在室温下放置，定期测定乳液的底部清层高度。

(3)

式中：CI，乳析指数，%；Ha,清层高度，cm；Ht，乳液的总高度，cm。

2 结果与讨论

2.1 SPI/SPH-阿拉伯胶体系的浊度分析

从图1看出在pH 5.0～7.0条件下，SPI/SPH-GA呈互溶状态；当pH为4.0时，吸光度值略有增加，可以推测SPI/SPH与阿拉伯胶形成了可溶性的复合物[10]；随着pH降低至3.0，SPI/SPH-GA体系的浊度较大，说明有不溶性复合物存在。酶解处理SPI后，最大浊度点向酸性pH偏移；SPI在pH 4.0～5.0及SPH在pH 3.0～4.0吸光度值显著增加，这主要是由蛋白质的聚集引起的；添加阿拉伯胶后，SPI或SPH自身聚集受到了抑制，提高了在等电点附近的溶解性。

2.2 乳液粒径及油滴表面的蛋白和阿拉伯胶吸附率

由表1可知，当去离子水为分散剂时，SPH稳定的乳液液滴粒径明显减小；SPH-GA乳液液滴粒径在酸性条件下也远小于SPI-GA乳液。当分散剂为10 g/LSDS时，乳液液滴间的絮凝被打破，测得的粒径为真实液滴粒径，发现在pH 3.0和pH 5.0条件下SPH乳液液滴粒径大于SPI，pH 4.0条件下变化不明显，这表明SPI聚集体仍具有较好的乳化性；SPH-GA在酸性条件下的液滴粒径大于SPI-GA乳液，可推出SPH-GA乳液液滴间絮凝程度较低。

表1 SPI/SPH-GA乳液液滴粒径(d43, 分散剂为水或SDS)、絮凝率(FI)及油水界面蛋白(AP1)和多糖 (AP2)的吸附率

在pH 3.0～5.0条件下，由于蛋白质疏水相互作用力及蛋白质和阿拉伯胶的静电相互作用力增强，造成吸附在油滴表面的蛋白质和阿拉伯胶明显增加[11]。与SPI乳液和SPI-GA乳液相比，SPH和SPH-GA乳液在pH 3.0～5.0下的蛋白质和多糖的吸附率降低，这可能是由于SPH分子间疏水相互作用力减弱，SPH与GA相互作用强度低于SPI与GA。

由表1还可以看出，SPH乳液的絮凝率明显低于SPI乳液，这一方面可能是由于在pH 4.0～5.0条件下静电斥力增强(图1)，另一方面是酶解改性后分子结构发生变化降低了液滴间絮凝。添加大分子阿拉伯胶促进液滴絮凝，但SPH-GA乳液液滴的絮凝程度率仍远小于SPI-GA乳液，原因可能是在酸性条件下SPH-GA乳液体系水相中存在一定量的阿拉伯胶分子，其长链结构造成的空间排阻抑制了油滴的絮凝。

2.3 乳液的流变性质

相比于pH 7.0，SPI和SPI-GA乳液黏度在pH 3.0～6.0下增加，原因可能有2个：一是在酸性条件下未吸附在油滴表面的SPI分子易形成聚集体或SPI与阿拉伯胶发生静电相互作用形成聚集体增加乳液的黏度；二是乳液液滴之间的絮凝程度较大造成酸性条件下黏度的增加。而SPH和SPH-GA乳液在酸性条件下的黏度低于中性条件，这主要是因为乳液液滴絮凝程度低并且SPH或SPH-GA稳定的乳液粒径较大(分散剂为10 g/L的SDS)，使得相同体积乳液中液滴数减少，所以造成在酸性条件下的黏度较低。对于同一pH条件下的乳液，阿拉伯胶添加后提高了乳液的黏度。从图2可以明显看到，添加阿拉伯胶前后SPH稳定的乳液黏度均低于SPI或SPI-GA乳液，黏度的降低说明乳液液滴之间的相互作用力减弱，酶解改性降低乳液液滴的絮凝。

2.4 乳析指数

由图3可知，SPI乳液在pH 4.0～6.0和SPH乳液在pH 3.0～5.0下静置1 d后均出现明显分层，主要是因为在靠近SPI或SPH等电点处表面电荷减少，蛋白质分子易聚集(图1)，导致乳液液滴间发生絮凝，突出表现为脂肪的上浮。添加阿拉伯胶后，SPI在pH 4.0～6.0条下的溶解性提高，并且在pH 4.0下形成可溶性复合物，根据DUCEL等人[12]报道,复合物相对于蛋白质本身来说具有更高的疏水性，提高其在油水界面吸附，形成较强的黏弹性膜；另外阿拉伯胶添加后液滴的流动性降低，故SPI-GA乳液比SPI乳液稳定性高，特别在pH 4.0下的乳析指数由45.71%减低至20%。阿拉伯胶明显提高pH 4.0条件下SPH乳液的稳定性，室温静置14 d后乳析指数仅为5.71%，从图1(B)可知SPH-GA在pH 4.0条件下形成了可溶性复合物，并且液滴絮凝率较低，黏度比pH 3.0和pH 5.0条件下偏高，这些均有利于SPH-GA乳液在pH 4.0条件下稳定；在pH 3.0条件下，虽然SPH-GA乳液的稳定性比SPH乳液有所提高，但效果明显不如pH 4.0条件，这可能因为SPH-GA不溶性复合物吸附在油水界面，形成紧密厚实的界面膜，有利于乳液的稳定，但是水相中未吸附的SPH和阿拉伯胶也形成不溶性复合物，这对乳液的稳定性是不利的，这两方面因素造成SPH-GA乳液在pH 3.0条件下稳定性提高不显著；而在pH 5.0条件下SPH-GA乳液比SPH乳液变得更易失稳，推测原因是SPH在pH 5.0条件自身形成了可溶性聚集体，而较大体积聚集体在油滴表面形成空间位阻，使得SPH分子不能完全覆盖在油滴表面[13]，油滴之间易发生聚结，并且在pH 5.0条件下SPH-GA乳液的黏度非常低，液滴的流动性较强更容易使得脂肪上浮，严重失稳。

图2 SPI(A)、SPI-GA(B)、SPH(C)和SPH-GA(D)乳液在不同pH下黏度随剪切速率的变化曲线Fig.2 Shear-rate dependence of viscosity for emulsions stabilized by SPI(A), SPI-GA(B), SPH(C) and SPH-GA(D) under different pH

图3 不同pH条件下SPI(A)、SPI-GA(B)、SPH(C)、SPH-GA(D)稳定的乳液的乳析指数Fig.3 Effects of storage time on the creaming index of emulsions stabilized by SPI(A)，SPI-GA(B)，SPH(C) and SPH-GA(D) under different pH

3 结论

阿拉伯胶的添加改善了SPI在pH 4.0～6.0条件下的乳化活性，促进SPI乳液液滴的絮凝，增加SPI乳液黏度，对在pH 4.0～6.0条件下的乳液稳定性有所改善；通过对SPI进行低限度酶解改性后制备的乳液液滴絮凝程度及乳液黏度明显降低，但单独的酶解产物稳定的乳液更易在pH在3.0～5.0失稳；pH 4.0条件下酶解产物与阿拉伯胶形成可溶性复合物能够明显提高乳液的稳定性，放置14天后乳析指数不到6%，并且SPH-GA乳液体系的黏度仍处于较低值。本实验结论对大豆蛋白在食品方面的应用具有指导意义，特别是稀的酸性乳饮料。

[1] KEERATI-U-RAI,CORREDIG M.4.45-Soy protein functionality: emulsion and gels[J].Comprehensive Biotechnology, 2011,4(2):543-551.

[2] SHAO Y,TANG C H.Characteristics and oxidative stability of soy proteinstabilized oil-in-water emulsions:influence of ionic strength and heat pretreatment[J].Food Hydrocolloids,2014,37:149-158.

[3] YUST M M,PEDROCHE J,MILLAN-LINARES M C,et al. Improvement of functional properties of chickpea proteins by hydrolysis with immobilised Alcalase[J].Food Chemistry,2010,122(4):1212-1217.

[4] SOARES DE CASTRO R J,BAGAGLI P P,SATO H H.Improving the functional properties of milk proteins:focus on the specificities of proteolytic enzymes[J].Current Opinion in Food Science,2015,1:64-69.

[5] ZHANG Ya-ting,TAN Chen,ABBAS S,et al.The effect of soy protein structural modification on emulsion properties and oxidative stability of fish oil microcapsules[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,120:63-70.

[6] YIN Bao-ru,ZHANG Rui-jing,YAO Ping.Influence of pea protein aggregates on the structure and stability of pea protein/soybean polysaccharide complex emulsions[J].Molecules,2010,20(3): 5 165-5 183.

[7] SIILVANA A,FIORAMONTI M J,MARTINEZ A M R,et al. Multilayer emulsions as a strategy for linseed oil microencapsulation: effect of pH and alginate concentration[J].Food Hydrocolloids,2015,43:8-17.

[8] LIU S,ELMER C,LOW N H,et al.Effect of pH on the functional behaviour of pea protein isolate-gum Arabic complexes[J]. Food Research International, 2010,43(2):489-495.

[9] LIANG Han-ning,TANG Chuan-he.Pea protein exhibits a novel pickering stabilization for oil-in-water emulsions at pH 3.0[J].Food Science and Technology,2014,58(2):463-469.

[10] 董蝶.大豆蛋白/阿拉伯胶复合物形成机理及其功能性质研究[D].无锡:江南大学,2016:25-26.

[11] ZHAO Qiang-zhong,LONG Zhao,KONG Jing,et al.Sodium caseinate/flaxseed gum interactions at oil-water interface:effect on protein adsorption and functions in oil-in-water emulsion[J].Food Hydrocolloids,2015,43:137-145.

[12] DUCEL V,RICHAR J,POPINEAU Y,et al. Rheological interfacial properties of plant protein-arabic gum coacervates at the oil-water interface[J].Biomacromolecules,2005,6(2): 790-796.

[13] 牛付阁.卵白蛋白-阿拉伯胶相互作用及其在油水界面上的吸附特性[D].无锡:江南大学,2016: 66-68.

Effect of pH and arabic gum on emulsifying properties of SPI/hydrolysates

JIA Cong,HUA Yu-fei,CHEN Ye-ming,ZHANG Cai-meng,KONG Xiang-zhen*

(Food Science College，Jiangnan University, Wuxi 214122,China)

The effect of pH and arabic bum on emulsifying properties of soy protein isolate (SPI) / hydrolysates was investigated. The results showed that SPI modified by enzymatic hydrolysis decreased size of emulsion particle and flocculation among droplets. The addition of arabic bum promoted absorption of SPI or soy protein hydrolysate (SPH) at interface between oil and water. The emulsion stabilized by SPH- arabic bum complexes possessed better emulsifying stability at pH 4. The viscosity of SPH emulsion was smaller than that of SPI before or after arabic bum addition.

soy protein isolate (SPI)；limited enzymatic hydrolysis；arabic bum；pH；emulsifying

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705005

硕士研究生(孔祥珍副教授为通讯作者,E-mail:xzkong@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金(31201380)

2016-11-11，改回日期：2016-12-14