代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸

梁姗姗，周丽，张斌，周哲敏

(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸

梁姗姗，周丽，张斌，周哲敏*

(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

β-丙氨酸是天然存在的唯一一种β型氨基酸，在医药、食品、化工等领域有重要应用。该研究考察了以重组Escherichiacoli发酵合成β-丙氨酸的可能性。在敲除副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因的EscherichiacoliCICIM B0016-050 (ackA-ptapflBadhEfrdAldhA)菌株中，考察叠加敲除β-丙氨酸的竞争途径天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因(lysC、panC、ptsG)以及过表达来源于Corynebacteriumglutamicum的panD基因对合成β-丙氨酸的影响。结果表明，叠加敲除上述基因后，β-丙氨酸的合成量依次提高了12.5%、39.3%和13.3%；过量表达panD基因，β-丙氨酸合成量提高了86.2倍；经发酵条件优化，菌株 B0016-080BB/pPL-panD摇瓶发酵可合成(5.0±0.2) g/L β-丙氨酸，体积生产强度达到(0.12±0.01) g/(L·h)。该结果为发酵法合成β-丙氨酸奠定了基础。

β-丙氨酸；大肠杆菌；L-天冬氨酸-α-脱羧酶；代谢工程；基因敲除

β-丙氨酸即3-氨基丙酸，是自然界中唯一存在的β型氨基酸，近年来，在医药、化工、食品、环境等领域的作用日渐突出[1]。在医药领域，主要用于合成泛酸以及泛酸钙，此外，β-丙氨酸还是合成肌肽(camosine)、帕米酸钠(pamidronate，第二代抗骨溶解药)、巴柳氮(balsalazide)等药物的原料；在化工领域，用于药剂制备中的沉淀剂，电镀缓蚀剂，铅中毒解毒剂等；在食品领域，可用作调味品；在环境领域用于水的净化絮凝剂等[2]。有报道称β-丙氨酸是未来全球12种最具开发潜力的三碳化工产品之一[3]。

国内外生产β-丙氨酸主要采用化学合成法，包括丙烯酸法、丙烯腈法、β-氨基丙腈法、β-氨基丙醇法等，这些方法合成工艺流程长，且需高温、高压，能耗大、生产过程对环境有一定的毒害作用。β-丙氨酸生物生产主要是采用微生物如产碱杆菌属Alcaligenessp. OMT-MY14、氨基杆菌属AminobacteraminobranceATCC 23314和红球菌Rhodococcussp. G20[4]，将β-氨基丙腈进行全细胞生物转化；KONST等人还利用L-天门冬氨酸-α-脱羧酶的酶转化法制备β-丙氨酸[5-6]，成为近年来研究的热点[6]，但其生产需要昂贵的前体和大量酶，还存在着高浓度底物抑制菌生长、产率较低等问题，不适合大规模工业化生产。Chan Woo Song等[7]构建了菌株E.coliCWF4NA2 (ΔiclRΔfumCΔfumAΔfumBΔptsGΔlacIPaspA::Ptrc Pacs::Ptrc)，首次采用发酵法在E.coli中合成β-丙氨酸，摇瓶发酵产量达3.94 g/L，但并未敲除有机酸、醇等副产物的合成途径，这些副产物的积累会导致β-丙氨酸得率降低，同时影响产物的化学纯度；此外，也未考察β-丙氨酸竞争代谢途径(lysC)和分解代谢途径(panC)的敲除对β-丙氨酸合成的影响；另外，以葡萄糖为碳源时，敲除ptsG[8]可显著增强丙酮酸激酶(Pck)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Ppc)的活性，从而提高草酰乙酸的积累量，而该基因在其它碳源存在时对β-丙氨酸合成的影响也未有报道。ZHOU等用PL启动子成功地对乳酸脱氢酶[9]和丙氨酸脱氢酶[10]进行开关控制，仅通过温控调节，在重组E.coli中实现了D-乳酸和L-丙氨酸的高产，将该方法应用于β-丙氨酸合成重组菌株，也有望大幅度提高β-丙氨酸的合成水平。

本文在实验室已有菌株E.coliB0016-050[11](敲除副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA)的基础上，敲除lysC、panC和ptsG基因，并将来源于Corynebacteriumglutamicum的panD基因克隆于温控强启动子PL下游，在上述重组菌株中进行高效表达，考察这些代谢途径的改造对发酵甘油合成β-丙氨酸的影响。

图1 E.coli菌株β-丙氨酸合成相关代谢途径及改造策略Fig.1 Metabolic pathway and strategy for β- alanine production in E.coli注：基因及其编码的酶: pflB, 丙酮酸甲酸裂解酶; ldhA, NAD依赖发酵型D-乳酸脱氢酶; pta, 磷酸转乙酰酶; ackA, 乙酸激酶; adhE, 乙醇脱氢酶; frdA, 富马酸还原酶; aspA, 天冬氨酸氨裂解酶; lysC, 天冬氨酸激酶; panC, 泛酸合成酶; ptsG, 主要的葡萄糖转运蛋白IICB(Glc); ppc, 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶; aspC, 天冬氨酸转氨酶; panD, 天冬氨酸-α-脱羧酶·黑点代表本研究所删除的基因

1 材料与方法

1.1 菌株与引物

1.1.1 菌株和质粒

本文所用到的菌株、质粒如表1所示。

E.coliB0016-050菌株为在野生型菌株E.coliCICIM B0016中敲除了基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA的重组菌株[11]，由本实验室构建、保藏。其他菌株由本文构建。

1.1.2 引物

本文所用到的引物如表2所示。

1.2 培养基

(1)LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10；酵母浸出粉5；NaCl 10(固体培养基，琼脂15)。

(2)M9-1液体培养基(g/L)：NaHPO4·12H2O 15.1；KH2PO43.0；NH4Cl 1.0；NaCl 0.5；(NH4)2SO413.21，补加50% (v/v)甘油 10 mL，200 g/L泛酸1 mL，0.1% (v/v) MgSO41 mol/L和0.1% (v/v)的微量元素母液。微量元素成分为(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4；CoCl2·6H2O 0.3；CuCl2·2H2O 0.15；ZnCl20.3；Na2MO4·2H2O 0.3；H3BO30.075；MnCl2·4H2O 0.495。

1.3 基因敲除方法

用 DATSENKO 等[12]报道的Red 重组系统基因敲除方法依次敲除B0016-050菌株染色体上的lysC、panC、和ptsG基因。其具体过程为： 以pKD13质粒为模板，分别用引物对LysC-PKD13R/LysC-PKD13F、PanC-PKD13R/PanC-PKD13F和PtsG -PKD13R/PtsG-PKD13F进行PCR 扩增，获得两端各具有50 bp 同源臂序列、中部为FRT-Kan-FRT 的突变盒片段。借助质粒pKD46 上的Red重组系统将突变盒整合于待突变菌株的染色体上，并用相应的验证引物对(YlysCF/YlysCR，YpanCF/YpanCR，YptsGF/YptsGR)进行菌落PCR 验证，最后用pCP20质粒去除重组菌中的卡那抗性基因，并进一步用相应验证引物进行验证。

表1 本研究中所使用的菌株和质粒

注：a：江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心；b：耶鲁大学基因保藏中心。

表2 本研究中所使用的引物

注a：小写字母表示与pKD13质粒同源碱基序列。

1.4 摇瓶发酵培养条件

种子培养：取-80 ℃甘油保藏的菌种，在氨苄青霉素抗性的LB平板划线，于33 ℃ 恒温培养24 h后，转接到 50 mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于33 ℃摇床200 r/min振荡培养至OD600=2.5。

发酵培养：将LB种子培养基转接至50 mL M9-1培养基中，使OD600终浓度为0.05，于33 ℃、200 r/min振荡培养至OD600=2.5(优化时OD600取：0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4)，补料1.5 mL 50% (v/v)甘油并用100 g/L的NaHCO3调节pH=7，同时调节温度至42 ℃诱导，继续200 r/min振荡培养，每6 h补加1 mL 50% (v/v)甘油，并用100 g/L的NaHCO3调节pH=7，48 h结束摇瓶发酵，每次试验采用3个平行并计算其平均值。

1.5 β-丙氨酸含量测定

发酵液预处理方法：发酵液样品10 000 r/min离心2 min，取上清液加入等体积100 g/L三氯乙酸，避光放置大于3 h，适当稀释后用0.45 μm滤膜过膜。利用邻苯二甲醛(OPA)试剂在线衍生β-丙氨酸，用高效液相色谱(HPLC)分析β-丙氨酸的含量。色谱柱为Diamonsil C18柱(250 cm×4.6 mm, 5 μm)，流动相A为：无水醋酸钠(分析纯)4.52 g，先溶于水，再加三乙胺 200 μL，四氢呋喃5 mL，水定容至1 L，醋酸调节pH 7.2；流动相B为：无水醋酸钠4.52 g 水定容为200 mL，醋酸调节pH 7.2，加400 mL甲醇和400 mL乙腈。采用梯度洗脱：0～27 min，B液由8%上升到60%，流速为1 mL/min；20～31.5 min，B液由60%上升到100%，流速为1 mL/min ；32～34 min，B液梯度不变，流速为1.2 mL/min。34～35 min，B液由100%下降到8%，流速为1 mL/min。柱温为40 ℃，检测波长为338 nm；进样量为10 μL。

2 结果和分析

2.1lysC、panC和ptsG基因的敲除

用 DATSENDO 等[12]报道的基因敲除方法，在菌株E.coliB0016-050中依次叠加敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因lysC、panC和ptsG(图1)，依次获得了B0016-060A、B0016-070B和B0016-080BB菌株(表1)。用验证引物对上述突变进行验证，结果如图2所示，lysC敲除前基因大小为1 714 bp，敲除后为469 bp；panC敲除前基因大小为1 334 bp，敲除后为587 bp；ptsG敲除前基因大小为1 770 bp，敲除后为340 bp。表明上述基因已成功删除。

M-DL 5 000 DNA maker；1-lysC敲除前；2-lysC敲除后；3-panC敲除前；4-panC敲除后；5-ptsG敲除前；6-ptsG敲除后图2 基因敲除PCR验证电泳图Fig.2 PCR verification of gene knockouts

2.2 pPL-panD重组质粒的构建

本实验室前期构建的质粒pET28a-panD[14]用BglⅡ和EcoR I进行双酶切，胶回收0.5 kb片段，克隆于pPL451质粒载体的BamH I和EcoR I酶切位点，获得重组质粒pPL-panD，其物理图谱如图3A所示。重组质粒pPL-panD用EcoR I进行酶切，电泳获得了4.8 kb 条带(图3B)，表明质粒构建正确。

M-DL 10 000 DNA maker；1- pPL-panD digested by EcoR I图3 pPL-panD重组质粒的物理图谱(A)和酶切验证电泳图谱(B)Fig.3 The map of the recombinant plasmid pPL- panD (A) and confirmation of pPL-panD by restriction digestion (B)

2.3 泛酸添加量的优化

敲除panC基因的B0016-070B菌株为营养缺陷型，不能在无泛酸的基本培养基上生长。向M9-1培养基中添加不同浓度的泛酸(0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5g/L)，菌体生长状况如图4所示。在不添加泛酸时，B0016-070B菌株基本不生长；添加量为10-4、10-5g/L时，菌体生长受到一定程度的抑制；泛酸添加量为10-2g/L时，B0016-070B菌体生长情况与未敲除panC基因的B0016-060A菌株的菌体生长情况相似，且再提高泛酸浓度，菌体生长情况不变。因此，后续实验在培养敲除了panC基因的菌株时，基本培养基中添加10-2g/L泛酸。

图4 B0016-070B 菌株泛酸添加量的优化Fig.4 Optimization of pantothenic acid concentration in B0016-070B

2.4 代谢途径敲除对β-丙氨酸合成的影响

通过摇瓶发酵实验，比较B0016-060A、B0016-070B和B0016-080BB菌株的β-丙氨酸合成水平。结果如图5所示，B0016-050菌株的β-丙氨酸产量为5.2 mg/L，B0016-060A菌株的β-丙氨酸合成量较B0016-050提高了35.1%，说明敲除lysC基因有助于L-天冬氨酸的积累，从而提高β-丙氨酸的产量；B0016-070B菌株的β-丙氨酸合成量较B0016-060A提高了595.8%，表明敲除panC基因阻断了β-丙氨酸的分解，从而使其合成量大幅度提高；B0016-080BB菌株的β-丙氨酸产量为49.3 mg/L，较B0016-070B提高了1.7%，说明敲除ptsG基因对β-丙氨酸的合成也有一定影响。

图5 基因敲除对β-丙氨酸合成的影响Fig.5 Effects of gene deletions on β-alanine synthesis

2.5panD基因的异源过表达对β-丙氨酸合成的影响

将pPL-panD质粒分别转化入菌株B0016-050、B0016-060A、B0016-070B、B0016-080BB，获得B0016-050/pPL-panD、B0016-060A/pPL-panD、B0016-070B/pPL-panD、B0016-080BB/pPL-panD重组株，进一步进行发酵实验检测其β-丙氨酸合成性能。

如图6所示，过量表达panD基因显著提高了β-丙氨酸合成量，B0016-050/pPL-panD菌株的β-丙氨酸合成量达2.4 g/L，比B0016-050重组菌株提高了464.1倍；B0016-080BB/pPL-panD重组菌β-丙氨酸合成量最高，达4.3 g/L，比B0016-080BB重组菌β-丙氨酸合成量提高了86.2倍。敲除lysC、panC和ptsG基因的B0016-060A/pPL-panD、B0016-070B/pPL-panD和B0016-080BB/pPL-panD菌株的β-丙氨酸合成量依次升高12.5%、39.3%和13.3%。可见，敲除天冬氨酸的分解途径关键基因lysC和β-丙氨酸的分解途径关键基因panC显著提高了β-丙氨酸的合成量；此外，也证明了在以甘油为碳源时，敲除ptsG基因同样可将增加β-丙氨酸代谢流。

图6 panD基因的过量表达对不同菌株发酵合成β-丙氨酸的影响Fig.6 Effect of over expression of panD on the synthesis of β-alanine in different strains

2.6 B0016-080BB/pPL-panD菌株摇瓶发酵优化

2.6.1 诱导时机的优化

ZHOU等优化了PL启动子调控的发酵过程，其最佳的菌体生长温度为33 ℃，而最佳的产物合成温度为42 ℃[9-10]。本文进一步对菌株B0016-080BB/pPL-panDβ-丙氨酸发酵过程中，这两个温度的转折时机进行优化，结果如图7所示。当菌体生长至OD600为2.5时，将发酵温度由33 ℃切换为42 ℃，β-丙氨酸合成量最高，达到4.9 g/L。因此，最佳温度诱导时机为OD600值达到2.5。

图7 B0016-080BB/pPL-panD菌株温度诱导时机的优化Fig.7 Optimization of thermo-induction of strain B0016-080BB/pPL-panD

2.6.2 发酵周期的优化

进一步对菌株B0016-080BB/pPL-panD的β-丙氨酸发酵周期进行优化。测定发酵液中的β-丙氨酸产量和菌体浓度，结果如图8所示。当摇瓶发酵42 h时，β-丙氨酸合成量最高，达到5.0±0.2 g/L，体积生产强度达到(0.12±0.005) g/(L·h)。因此，菌株B0016-080BB/pPL-panD的最佳摇瓶发酵周期为42 h。

图8 B0016-080BB/pPL-panD菌株摇瓶发酵时间的优化Fig.8 Optimization of fermentation time of strain B0016-080BB/pPL-panD

3 结论

本文在去除了有机酸、醇副产物的重组E.coliB0016-050菌株中，删除β-丙氨酸竞争代谢途径(lysC)和分解途径基因(panC)，可显著提高β-丙氨酸的积累量；并证明了在以甘油为碳源时，敲除ptsG基因同样可提高β-丙氨酸合成量。此外，用温控型PL强启动子调控谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达，可显著提高重组E.coli的β-丙氨酸合成水平。优化后B0016-080BB/pPL-panD菌株β-丙氨酸合成量达到(5.0±0.2) g/L，体积生产强度达到(0.12±0.005) g/(L·h)。

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Metabolic engineering ofEscherichiacolifor the production of β-alanine

LIANG Shan-shan, ZHOU Li,ZHANG Bin, ZHOU Zhe-min*

(Schoool of Biotechnology and the Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

β-Alanine, the only kind of β amino acid which exists naturally, has important applications in medicine, food and chemical industry. In this study, the possibility of metabolic engineering ofEscherichiacolifor the production of β-alanine was investigated. TheEscherichiacoliCICIM B0016-050 (ackA-ptapflBadhEfrdAldhA) strain with deletions on synthetic pathways of acetic acid, formic acid, ethanol, succinic acid and lactic acid, was used as the starting strain. Effects of gene knockouts oflysC(encoding aspartokinase),panC(encoding pantothenate synthetase) andptsG(encoding the major glucose transporter IICB (Glc)) and overexpression of theCorynebacteriumglutamicumpanDgene (encodingL-aspartate-α-decarboxylase) on synthesis of β-alanine in B0016-050 were investigated. The synthesis of β-alanine was improved by 12.5%, 39.3% and 13.3%, respectively, after combined gene knockouts, and was increased by more than 100.6 times after overexpressing thepanDgene. After optimization of fermentation conditions, the yield of β-alanine in the shake flask fermentation of strain B0016-080BB/pPL-panDreached 5.0±0.2 g/L, and the volume productivity was 0.12±0.01 g/(L·h). The results laid the foundation for fermentation of β-alanine.

β-alanine;Escherichiacoli;L-aspartate-α-decarboxylase;metabolic engineering;gene knockout

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705003

硕士研究生(周哲敏教授为通讯作者,E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金项目(31300087)；基本科研-重点项目(JUSRP51611A)

2017-01-05，改回日期：2017-02-09