结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变情况及其临床意义

陈伊，韦常宏，宁淑芳，韦文娥，刘海洲，利基林，张力图

(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)

结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变情况及其临床意义

陈伊，韦常宏，宁淑芳，韦文娥，刘海洲，利基林，张力图

(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)

目的 探讨结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变情况及其临床意义。方法 选择行手术治疗的结直肠癌患者262例，采用ARMS-PCR法检测其结直肠癌组织KRAS基因外显子2第12、13位密码子及BRAF V600E基因突变情况，分析其与患者临床病理参数、肝转移及预后的关系。结果 262例结肠癌患者中女性患者98例。262例份结肠癌组织中，KRAS基因突变49例(18.7%)，其中第12位密码子突变37例(包括1例KRAS复合突变)，第13位密码子突变12例；184例份结肠癌组织中，BRAF V600E基因突变6例。结直肠癌组织KRAS基因突变与患者性别(女性)、原发肿瘤直径、远处转移情况均有关，BRAF基因突变与民族、家族史、原发肿瘤分化程度均有关(P均<0.05)。同时性肝转移患者KRAS基因突变率高于异时性肝转移患者，KRAS基因G13D突变率低于异时性肝转移患者(P均<0.05)。KRAS基因突变的结直肠癌患者生存时间短于未突变者(P<0.05)。KRAS基因突变是结直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.01)。BRAF基因突变与未突变者生存时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 结直肠癌组织KRAS基因突变率高，BRAF基因突变率低；KRAS基因突变多发生于女性，与结直肠癌的发生、发展有关。

结直肠癌；KRAS基因；BRAF基因；基因突变；预后

KRAS基因是EGFR信号通路上的一个重要作用靶点，抗EGFR单克隆抗体(西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗结直肠癌的疗效与KRAS基因突变状态密切相关，只有KRAS野生型患者才可从抗 EGFR单克隆抗体单药治疗或联合化疗中获益[1]。BRAF V600E基因是KRAS基因下游的作用位点，其突变状态可能会影响抗EGFR单克隆抗体的治疗效果。2009年1月～2012年12月，本研究观察了结直肠癌组织KRAS与BRAF基因的突变情况，现分析结果并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期于广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的结直肠癌患者262例，男164例、女98例，年龄24～87岁、中位年龄55岁；民族：汉族182例、壮族70例、其他10例；家族史：结直肠腺癌家族史4例、大肠腺瘤家族史2例、溃疡性结肠炎家族史2例、家族性腺瘤性息肉病1例；组织学类型：腺癌229例、黏液腺癌+印戒细胞癌33例；肿瘤部位：左半结肠81例、右半结肠70例、直肠111例；原发肿瘤分化程度：低分化93例、中分化161例、高分化8例；原发肿瘤直径：≤5 cm 146例、>5 cm 116例；T分期：T1、T2期20例、T3、T4期242例；N分期：N0期95例、N1期98例、N2期69例；远处转移情况：无转移70例、肝转移135例、其他部位转移57例；肝转移情况：同时性肝转移105例、异时性肝转移30例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期35例、Ⅲ、Ⅳ期227例。均经病理组织学检查确诊为结直肠癌，术前均未接受抗EGFR靶向治疗。本研究经医院伦理委员会审核，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 癌组织KRAS、BRAF基因突变检测 采用ARMS-PCR法。收集262例患者术中切除的新鲜肿瘤组织，立即放入液氮中冷冻， -80 ℃冰箱保存。将组织进行甲醛固定、石蜡包埋，4 μm厚切片，脱蜡、水化，共10张切片。取1张切片进行HE染色，显微镜下选择肿瘤细胞富集区域，确保其肿瘤细胞比例≥80%。取其余9张切片，参照DNeasy Blood &Tissue Kit和QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒(德国Qiagen公司)说明书提取样本DNA，采用ARMS-PCR法检测KRAS基因外显子2第12、13位密码子突变情况。其中184例份结直肠癌组织仅行BRAF V600E突变检测。参照人类KRAS基因7种突变检测试剂盒和人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒说明书，KRAS基因外显子2上游引物：5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′，下游引物：5′-GGTGCAGGACCATTCTTTGA-3′，目的片段：173 bp；BRAF基因第15号外显子上游引物：5′-GCTFGCTCTGATAGGAAAATGAG-3′，下游引物：5′-GTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3′，目的片段：237 bp。反应循环参数：95 ℃、5 min；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s，循环15次；93 ℃、25 s，60 ℃、35 s，72 ℃、20 s，循环31次。每次试验均按要求设定阴性、阳性对照孔及空白对照孔。使用Roche480Ⅱ实时荧光定量PCR仪进行检测，PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳确定后，根据突变检测试剂盒说明书提供的判读原则，将样品ΔCt值(突变Ct值-外控Ct值)与信号阈值比较，样品检测结果分为阳性和阴性。

1.3 相关性分析 分析KRAS、BRAF基因突变与患者临床病理参数的关系；随访至2015年12月，以死亡为终点事件，绘制生存曲线，分析KRAS、BRAF基因突变与患者生存时间及预后的关系。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。KRAS、BRAF基因突变率与临床病理参数的关系采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-Rank检验法分析KRAS、BRAF基因突变对患者生存时间的影响，COX比例风险回归模型进行预后影响因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS、BRAF基因突变情况 262例份结肠癌组织中，KRAS基因突变49例(18.7%)；第12位密码子突变37例(14.1%)，包括1例KRAS复合突变(G12V和G12R同时突变)，第13位密码子突变12例(4.6%)，未检出第12、13位密码子同时突变；其余均未发生突变。184例份结肠癌组织中，BRAF V600E基因突变6例(3.3%)。见表1。同时性与异时性肝转移患者KRAS基因突变率分别为27.6%(29/105)、6.7%(2/30)，二者比较P<0.05； KRAS基因G13D突变率分别为4.8%(5/105)、30%(9/30)，二者比较P<0.05；同时性与异时性肝转移患者KRAS基因其他类型突变率比较P均>0.05。

2.2 结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变与患者临床病理参数的关系 见表2。

2.3 结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变与患者预后的关系 患者术后随访2.37～77.31个月，失访8例，随访率为96.9%。 共30例患者死亡， 中位

表1 结直肠癌组织中KRAS、BRAF基因突变情况

注：检出1例KRAS复合突变，为G12V和G12R同时突变。

表2 结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变与患者临床病理参数的关系

生存时间为22.43个月。生存曲线分析结果显示，KRAS基因突变的结直肠癌患者生存时间为(27.43±3.2)个月，未突变者为(46.22±4.25)个月，二者比较P<0.05；BRAF基因突变的结直肠癌患者生存时间为(31.23±3.61)个月，未突变者为(35.93±2.19)个月，二者比较P>0.05。COX比例风险回归模型多因素分析结果显示，KRAS基因突变是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素(β=2.044，RR=7.725，95%CI：2.722～21.927，P<0.01)。

3 讨论

结直肠癌的发生、转移是一个受多基因、多因素影响的过程，EGFR与肝转移密切相关[2]。KRAS、BRAF基因是该信号通路下游的重要位点，其中BRAF基因又是KRAS基因下游的重要位点，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。KRAS基因野生型患者能从抗EGFR靶向治疗中获益，但仍有部分患者对抗EGFR药物治疗无反应；BRAF基因与抗EGFR治疗效果的关系目前无统一定论，尚不能单独作为预测因子。本研究结直肠癌组织KRAS基因突变率为18.7%，BRAF基因突变率为3.3%，与目前国内外研究报道接近[3～5]。一项来自多地区、纳入6 346例患者的研究表明， G12R突变为我国罕见突变类型[6]。本研究检出1例G12R突变，该患者同时伴有G12V突变；并未检出KRAS基因第12、13位密码子同时突变，表明各密码子突变是相互独立的。V600E为BRAF基因的常见突变位点，本研究显示该位点突变率较低，仅为3.3%。

高静等[4]研究认为，KRAS突变更易发生在女性且分化程度较好的右半结肠癌患者中，并与年龄有关。也有研究认为，KRAS基因突变与结直肠癌患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤位置等临床病理参数均无关[7，8]。本研究结果显示，结直肠癌组织KRAS基因突变与患者的性别、原发肿瘤直径、远处转移情况均有关。Chen等[9]大样本Meta分析结果显示，女性、老年患者以及右半结肠癌患者BRAF基因突变率较高；但也有研究显示BRAF突变与临床病理参数之间无显著性关系[10]。本研究中结直肠癌组织BRAF基因突变与患者的民族、家族史、原发肿瘤分化程度均有关。

KRAS、BRAF基因突变对结直肠癌患者肝转移及预后的影响报道不一[10,11]。Bazan等[12]认为，KRAS基因第13位密码子突变与高度侵袭性结直肠癌相关，预示其可能是肿瘤扩散和导致患者死亡的独立危险因素。Yaeger等[13]研究表明，BRAF基因突变与转移性结肠癌预后差有关，伴有该基因突变的患者更容易发生肝、腹膜转移，且转移瘤术后生存期更短。Modest等[14]研究结果表明，KRAS基因第13位密码子突变与结直肠癌发生同时性肝转移及局部转移相关。梁立等[15]指出，结直肠癌同时性肝转移与RAS-RAF-ERK、P13K-PTEN-AKT通路同时激活有关，异时性肝转移与P13K-PTEN-AKT单独激活、RAS-RAF-ERK不激活有关。本研究结果显示，同时性肝转移患者KRAS基因突变率高于异时性肝转移患者，KRAS基因G13D突变率低于异时性肝转移患者。G13D突变有一定的疗效评估作用，G13D突变的结直肠癌患者能从一线西妥昔单抗治疗中获益，而且其获益程度与KRAS野生型相仿，提示KRAS基因G13D突变的特殊性。由于已经得出BRAF基因突变与患者远处转移情况无关的结果，故本研究未对同时性与异时性肝转移患者的BRAF基因突变率进行对比分析。文献报道，KRAS第13位密码子突变的患者较未突变者生存期更短[5, 16]。但本研究结果显示，KRAS基因突变的结直肠癌患者生存时间明显短于未突变者，KRAS基因突变是结直肠癌患者预后的独立危险因素，提示KRAS基因突变患者预后较差；但本研究并未发现KRAS基因G13D突变、BRAF基因突变与预后的关系，可能与样本量小、随访时间短有关。

综上所述，结直肠癌组织KRAS基因突变率高，BRAF突变率低；KRAS基因突变多发生于女性，与结直肠癌的发生、发展有关。未来将进一步明确KRAS基因在结直肠癌肝转移中的作用，及其突变相关生物标志物的表达变化，以期为结直肠癌的快速诊断、病情判断及预后评估提供理论依据。

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广西科学研究与技术开发计划基金资助项目(桂科攻1298003-2-8)；南宁市青秀区科学研究与技术开发计划基金资助项目(2015S03)。

张力图(E-mail： zhanglitu@gmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.026

R735.3

B

1002-266X(2017)16-0077-04

2016-10-13)