氯化锂对激素性股骨头坏死大鼠股骨头微观结构的影响

2017-06-19 19:27李云矗孙平徐刚徐成福
山东医药 2017年16期
关键词:氯化锂小梁骨细胞

李云矗,孙平,徐刚,徐成福

(1牡丹江医学院,黑龙江牡丹江157011;2牡丹江医学院红旗医院)

氯化锂对激素性股骨头坏死大鼠股骨头微观结构的影响

李云矗1,孙平1,徐刚2,徐成福2

(1牡丹江医学院,黑龙江牡丹江157011;2牡丹江医学院红旗医院)

目的 探讨氯化锂对激素性股骨头坏死(S-ONFH)大鼠股骨头微观结构的影响及意义。方法 将30只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、氯化锂组,每组10只。氯化锂组和模型组采用大肠杆菌内毒素联合大剂量激素冲击法建立S-ONFH模型,末次注射激素24 h,氯化锂组给予氯化锂140 mg/kg灌胃,1次/d,连续8周。模型组和空白对照组均给予等量生理盐水灌胃。各组灌胃8周处死,取右侧股骨头行HE染色,观察股骨头组织病理学改变及股骨头坏死发生情况;取左侧股骨头进行显微CT检查,记录骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨小梁数目(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)。结果 HE染色显示,空白对照组骨小梁完整,排列规则,骨陷窝内有骨细胞填充;模型组骨小梁结构紊乱并有狭窄或断裂,广泛存在以空骨陷窝为标志的坏死骨;氯化锂组骨小梁形态较好,未见明显狭窄或断裂,存在空骨陷窝,但数量较模型组少。空白对照组、模型组、氯化锂组分别有0、8、3只出现股骨头坏死,组间两两比较P均<0.05。与空白对照组比较,模型组和氯化锂组Tb.N、Tb.Th均降低,Tb.Sp均增高,但模型组变化更明显(P均<0.05)。模型组BMD、BV/TV均低于空白对照组和氯化锂组(P均<0.05)。结论 氯化锂灌胃可改善S-ONFH大鼠股骨头微观结构,对股骨头具有一定保护作用。

激素性股骨头坏死;氯化锂;骨量;骨微观结构;大鼠

激素性股骨头坏死(S-ONFH)是由于长期应用激素类药物而导致的、以股骨头塌陷为特征的代谢性疾病,是临床公认的难治性骨科疾病[1,2]。研究证实,骨细胞活性改变在S-ONFH的发生、发展中具有关键作用。破骨细胞分化和活性升高可提高骨吸收速率;而成骨细胞分化障碍及其脂肪变或活性降低则使骨形成受到抑制,随后出现骨吸收与骨形成失衡,导致骨质成分缺失和修复障碍[3,4]。临床上针对S-ONFH的治疗原则是抑制破骨细胞增殖及骨细胞凋亡、促进成骨细胞增殖[5]。研究发现,锂盐在增强成骨代谢的同时还可抑制破骨代谢[6]。但目前氯化锂预防及治疗S-ONFH的基础及临床研究报道均较少。为此,我们于2016年2~9月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:清洁级雄性SD大鼠30只,体质量(200±30)g,许可证号:SCXK(黑)20013001,由哈尔滨医科大学实验动物中心提供;于牡丹江医学院解剖学馆模型室按照标准饲养条件进行饲养,温度22~26 ℃,相对湿度37%~42%,换风次数15~20次/h,光照强度150~200 Lx、每12 h昼夜交替,噪音<50 dB;自由摄食饮水,每笼5只。主要试剂:大肠杆菌内毒素(L2880,美国Sigma公司),注射用甲泼尼松龙琥珀酸钠(A07056,美国Pfizer公司),氯化锂(746460-100G,美国Sigma公司),水合氯醛(H37022673,上海山浦化工有限公司),伊红试剂、苏木素试剂(C-0021,北京博奥森生物技术有限公司) 。主要仪器:显微CT(Micro CT,瑞士SCANCO公司),切片机(HM315,德国美康公司),光学显微镜(80i,日本Nikon公司),数码照相机(D7100,日本Nikon公司)。

1.2 建模与分组处理 将30只SD大鼠适应性喂养2周,根据随机数字表法分为空白对照组、模型组、氯化锂组,每组10只。氯化锂组和模型组参照董玉雷等[7]的方法建立S-ONFH模型,方法如下:大肠杆菌内毒素20 μg/kg腹腔注射2次,间隔24 h;末次注射内毒素24 h,给予甲泼尼龙琥珀酸钠40 mg/kg臀肌注射3次,每次间隔24 h。空白对照组仅注射等量生理盐水。末次注射甲泼尼龙琥珀酸钠24 h,氯化锂组参照牛银波等[8]的方法给予氯化锂140 mg/kg灌胃,1次/d,连续8周。模型组和空白对照组均给予等量生理盐水灌胃。

1.3 氯化锂对S-ONFH大鼠股骨头影响的观察

1.3.1 一般情况 观察各组建模及处理过程中的精神状态、活动、饮食、存活等情况。

1.3.2 股骨头大体情况 各组处理8周,腹腔注射过量水合氯醛,颈椎脱臼处死。取出左、右两侧股骨,肉眼观察股骨头外观、色泽及关节面软骨情况。

1.3.3 股骨头组织病理学改变 将各组右侧股骨头置于多聚甲醛溶液固定72 h,置于10% EDTA-Tris缓冲液中脱钙,待脱钙完全后,流水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,4 μm厚切片。常规进行HE染色,由牡丹江医学院病理学教研室协助完成,由2位病理科医师独立采用盲法观察组织病理学改变。股骨头坏死标准参照Ikemura等[1]的方法,即出现骨髓细胞碎片、骨小梁空骨陷窝或骨小梁内骨细胞核固缩,并伴随周围骨髓细胞的坏死则定义为股骨头坏死。记录各组股骨头坏死的发生情况。

1.3.4 股骨头微观结构 采用Micro CT检查。将各组左侧股骨头标本置于多聚甲醛溶液固定,送往杭州越波生物科技有限公司进行Micro CT检查。选择20 μm数量级进行薄层扫描,扫描电压为80 kV,电流为160 μA,全扫描过程均在多聚甲醛溶液固定下完成。扫描结束后,使用Micro View2.2软件对整个股骨头图像进行三维重建,对比观察各组的三维重建图。手工选取股骨头内直径为2 mm、高1.48 mm的圆柱体作为感兴趣区域(ROI),分析该选定区域的骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨小梁数目(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

2 结果

2.1 一般情况 各组均存活,空白对照组建模及处理过程中精神状态、活动、饮食均无明显变化。氯化锂组和模型组注射大肠杆菌内毒素第1、2天出现寒颤、蜷缩,饮食、活动均减少,精神状态较差;注射甲泼尼龙琥珀酸钠1周后,活动、饮食恢复正常,四肢负重未见明显异常。氯化锂组和模型组处理8周末均出现轻度跛行,以模型组较为明显。

2.2 股骨头大体情况 空白对照组股骨头直径约2 mm,呈圆形,颜色均一、呈淡红色,表面覆盖一层光滑软骨。氯化锂组和模型组股骨头可见片状软骨下坏死,软骨变薄,颜色呈暗红色,以模型组较为明显。

2.3 股骨头组织病理学改变 HE染色显示,空白组骨小梁完整,排列规则,骨陷窝内有骨细胞填充;模型组骨小梁结构紊乱并有狭窄或断裂,广泛存在以空骨陷窝为标志的坏死骨;氯化锂组骨小梁形态较好,未见明显狭窄或断裂,存在空骨陷窝,但数量较模型组少。空白对照组、模型组、氯化锂组分别有0、8(80%)、3(30%)只出现股骨头坏死,组间两两比较P均<0.05。

2.4 股骨头微观结构 Micro CT三维重建图:空白对照组骨小梁粗厚,清晰可见,排列规则、紧密,股骨头表面光滑、无塌陷;模型组骨小梁变细,排列混乱、稀疏,骨小梁间距增大,并出现大量的骨小梁微骨折,股骨头表面毛糙不平、塌陷面积较大;氯化锂组骨小梁较细,排列部分混乱,骨小梁间距较小,部分骨小梁出现微骨折,股骨头表面塌陷面积较小。股骨头微观结构相关指标:与空白对照组比较,模型组和氯化锂组Tb.N、Tb.Th均降低,Tb.Sp均增高,但模型组变化更明显(P均<0.05)。模型组BMD、BV/TV均低于空白对照组和氯化锂组(P均<0.05),空白对照组和氯化锂组BMD、BV/TV比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组股骨头微观结构相关指标比较

注:与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。

3 讨论

骨代谢是指骨不断进行的重建过程,骨重建过程包括破骨细胞黏附在旧骨区域并消化骨基质、溶解矿物质形成骨吸收陷窝;同时成骨细胞移行至被吸收部位,分泌骨基质,骨基质矿化形成新骨[9]。在正常情况下,骨的吸收和形成处于动态平衡,骨重建过程不会造成骨量及BMD改变,更不会引起骨坏死。而在股骨头坏死状态下,股骨头骨代谢的改变造成骨吸收加速、新骨形成减慢,从而导致股骨头局部发生骨质疏松,诱发骨坏死,在持续应力作用下造成股骨头骨小梁发生断裂,最终引起股骨头塌陷[10]。

研究表明,锂盐对骨代谢有积极的影响。锂盐通过抑制糖原合成激酶3β的活性,激活经典Wnt信号通络,促进成骨细胞增殖、分化,从而增强骨组织的成骨代谢[11];还可以通过抑制破骨细胞RANKL基因的表达而降低破骨细胞增殖、分化,抑制破骨代谢[12]。近年研究显示,锂盐可以促进小鼠骨形成[13]、改善骨质疏松[14],增加大鼠BMD[15],为锂盐治疗骨坏死提供了良好的理论基础。目前评价骨微观结构最好的方法是Micro CT扫描,已受到越来越多研究者的青睐,并将其成功应用于骨关节炎、骨质疏松动物模型骨微观结构的观察。Micro CT可清楚显示骨小梁微观结构,同时结合软件进行骨组织形态计量学分析。骨组织形态计量学可直观反映骨组织的三维参数。BMD是评价骨皮质厚度、骨小梁结构和骨量的重要指标,也是衡量骨丢失程度的指标之一[16]。BV/TV、Tb.Sp、Tb.N及Tb.Th均可反映骨组织结构的完整性。BV/TV是骨小梁体积占骨组织体积的百分比,反映骨量变化。Tb.N和Tb.Th用于描述骨小梁的结构形态,也可反映骨量变化。Tb.Sp是指骨小梁之间的平均距离,用来反映骨小梁结构形态,Tb.Sp越大表明骨小梁之间的距离越大,骨的结构越差,力学强度越小。

本研究以成年SD大鼠作为研究对象,通过大肠杆菌内毒素联合大剂量激素冲击建立S-ONFH模型,方法与董玉雷等[7]、童培建等[17]报道相同;并参照沈兴潮等[18]的方法,采用Micro CT评价S-ONFH动物模型的股骨头微观结构。本研究结果显示,与空白对照组比较,模型组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均降低,Tb.Sp升高,结合模型组股骨头大体情况以及组织病理学改变,说明成功建立S-ONFH模型。本研究氯化锂组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th较模型组增高,Tb.Sp较模型组降低;股骨头大体情况观察显示,氯化锂组和模型组股骨头均可见片状软骨下坏死,软骨变薄,颜色呈暗红色,以模型组较为明显;组织病理学观察显示,氯化锂组骨小梁形态较好,未见明显狭窄或断裂,存在空骨陷窝,但数量较模型组少。以上均说明,氯化锂可明显改善S-ONFH大鼠股骨头的微观结构,在骨坏死修复过程中使骨小梁数量、形态等均趋近正常,同时又能明显提高BMD,具有预防或延缓S-ONFH的作用。分析原因,可能是氯化锂一方面可抑制破骨代谢,保持骨小梁不被破骨细胞介导的骨吸收所破坏,另一方面可以有效促进坏死区成骨代谢,促进股骨头坏死区的修复。

综上所述,氯化锂可改善S-ONFH大鼠股骨头的微观结构,对股骨头坏死的发生具有一定预防作用。本研究只设定了单个观察时间点和单个给药剂量,在后续的研究中将进行多个时间点和多个给药剂量的动态观察,以探讨给药时间和给药剂量对氯化锂预防S-ONFH作用的影响。结合组织学、生物化学和基因学等检测手段探讨氯化锂预防S-ONFH的作用机制是未来研究的方向。

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山东卫生报刊社

Effects of lithium chloride on microstructure of femoral head in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

LIYunchu1,SUNPing,XUGang,XUChengfu

(1MudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China)

Objective To investigate the effect of lithium chloride on microstructure of femoral head in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (S-ONFH) and its significance. Methods Thirty SD rats were randomly divided into the blank control group, model group and lithium chloride group, with 10 rats in each group. In the lithium chloride group and model group, we used escherichia coli endotoxin combined with large dose of steroid shock to make the rat models of the S-ONFH. At 24 h after the last injection of steroid, rats in the lithium chloride group were given lithium chloride (140 mg/kg) by gavage, 1 time per day for 8 weeks. Rats in the model group and the blank group were given equal amount of normal saline. Rats were sacrificed and HE staining was performed on the right femoral head. Histopathological changes and necrosis of the femoral head were observed. The left femoral head was used for micro CT examination, and each bone mineral density (BMD), bone volume fraction (BV/TV), trabecular space (Tb.Sp), trabecular bone number (Tb.N), trabecular bone thickness (Tb.Th) were recorded. Results HE staining showed that the trabecular bone in the blank group was complete and regularly arranged, and the bone lacunae were filled with bone cells; the trabecular bone in the model group was disorder, narrow, and fractured, and the marked necrosis of bone widely existed in the empty bone lacunae; the trabecular bone shape in the lithium chloride group was better without obvious stenosis or fracture. However, there were empty bone lacuna in the lithium chloride group which was less than that in the model group. In the blank control group, model group and lithium chloride group, 0, 8 (80%) and 3 (30%) rats with femoral head necrosis were found, respectively (allP<0.05). Compared with the blank control group, the Tb.N and Tb.Th of the model group and the lithium chloride group were all decreased, Tb.Sp was increased, but these in the model group expressed more significantly (allP<0.05), the BMD and BV/TV in the model group was lower than that of the the blank control group and lithium chloride group (allP<0.05). Conclusion Lithium chloride can increase the bone mass of S-ONFH rat femoral head and improve its microstructure, and it has a protective effect on the femoral head.

steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (S-ONFH); lithium chloride; bone mass; bone microstructure; rats

牡丹江医学院研究生创新科研项目(2014YJSCX-12);牡丹江医学院科学技术研究项目(ZSSD201623)。

李云矗(1991-),男,硕士研究生在读,研究方向为激素性股骨头坏死的预防与治疗。E-mail: 664159525@qq.com

孙平(1973-),女,副教授,研究方向为炎症与肿瘤的关系。E-mail: spmy73@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.005

R681.8

A

1002-266X(2017)16-0016-04

2016-11-02)

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