LC—MS/MS同时测定痛安注射液中13个成分的含量

尚婵+李孟璇+李海波+何亮伟+孟兆青+黄文哲+王振中+丁岗+杨中林+萧伟

[摘要] 利用超高效液相色譜-质谱联用仪 （UPLC-MS/MS） 建立了同时测定痛安注射液（TAI）中丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱共13个有效成分的定性定量检测方法，用于痛安注射液的质量控制。采用Agilent Zorbax SB-Aq C18柱 （2.1 mm×150 mm，3.5 μm） 色谱柱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱（0.01～2 min，5%B；2～8 min，5%～30%B；8～11 min，30%～95%B；11～13 min，95%B；13～13.1 min，95%～5%B；13.1～14 min，5%B），流速0.5 mL·min^-1，柱温25 ℃；电喷雾离子源 （ESI） 正离子条件下检测，多反应离子监测 （MRM） 进行定量。结果所测上述 13个待测成分在测定的质量浓度范围内均具有良好的线性关系 （r>0.999 0）；加样回收率在 95.70%～104.8%，RSD 均小于1.9%，10个批次样品中上述13种成分的质量浓度依次为0.021 2～0.029 0，0.001 7～0.002 3，0.000 9～0.001 3，5.952～6.205 2，0.195 4～0.240 5，0.002 0～0.002 9，0.693～0.798 2，0.069 3～0.078 2，0.089 29～0.102 9，0.386 5～0.420 1，0.014 3～0.015 9，0.755 3～0.842 1，0.008 2～0.011 2 g·L^-1。经方法学验证，该方法简便、快速、准确、重复性好，可以为综合评价痛安注射液的质量提供参考。通过对10个批次的痛安注射液进行分析测定，并根据含量测定结果表明不同批次痛安注射液的质量并无明显差异，从而为痛安注射液的质量控制提供依据。

[关键词] 痛安注射液； 超高效液相色谱串联质谱法； 生物碱； 黄酮； 木脂素； 中药多成分分析

[Abstract] The aim of this study was to develop a simple， sensitive ultra performance liquid chromatography mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the determination of syringaresinol， N-trans-feruloyltyramine， chelerythrine chloride， sinomenine， coptisine chloride， sanguinarine， chelidonine， magnolflorine， allocryptopine， protopine， farrerol， stylopine and dihydrosanguin-arine in Tong′an injection （TAI）， which could be used for the quality control of TAI. The UPLC analysis was performed on Agilent Zorbax SB-Aq column （2.1 mm×150 mm，3.5 μm）， with 0.1% formic acid solution （A） -acetonitrile （B） as the mobile phase for gradient elution （0.01-2 min， 5%B； 2-8 min， 5%-30%B； 8-11 min， 30%-95%B； 11-13 min， 95%B； 13-13.1 min， 95%-5%B； 13.1-14 min， 5%B）. The flow rate was 0.5 mL·min^-1， and the column temperature was 25 ℃； multiple reaction monitoring （MRM） was performed in electrospray ion source positive ion mode for quantitative determination. The calibration curves for the above thirteen compounds showed good linear relationship in corresponding mass concentration range （r>0.999 0）. The average recovery rate of the compounds ranged from 95.70% to 104.8%， with RSD of less than 1.9%. The contents of thirteen active components in 10 batches of TAI were 0.021 2-0.029 0， 0.001 7-0.002 3， 0.000 9-0.001 3， 5.952-6.205 2， 0.195 4-0.240 5， 0.002 0-0.002 9， 0.693-0.798 2， 0.069 3-0.078 2， 0.089 29-0.102 9， 0.386 5-0.420 1， 0.014 3-0.015 9， 0.755 3-0.842 1， and 0.008 2-0.011 2 g·L^-1 respectively. Methodology validation proved that this method was simple， rapid， sensitive and accurate， which can be used to provide reference for the comprehensive evaluation of TAI quality. The determination results of 10 batches of TAI showed the content of each batch had no significant difference. The results may provide a basis for the quality control of TAI.

[Key words] Tong′an injection； UPLC-MS/MS； alkaloid； flavonoids； phenylpropanoids； multi-component analysis of Chinese patent medicine

痛安注射液（Tong′an injection，TAI）处方来源于广州肿瘤医院李瑞甫主任医师提供的临床经验方[1]，该处方由青风藤、白屈菜、汉桃叶3味常用中药材精制而成。白屈菜与青风藤中主要含有生物碱类成分[2-3]；汉桃叶中主要活性成分为有机酸[4]。白屈菜为君药，青风藤为臣药，汉桃叶为佐药，痛安注射液临床上主要用于放化疗或非放化疗的肺癌、肝癌、胃癌等肿瘤属血瘀引发的癌性中度疼痛[5]。

前期本課题组利用活性追踪指导分离方法，对痛安注射液抗炎部位进行了系统的化学成分分离，但有些化合物在痛安注射液中含量较少，且色谱峰分离度低，无法通过HPLC测定其含量，为了更加有效地控制其质量，本研究建立了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法同时测定痛安注射液中生物碱（N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、次罂粟碱、二氢血根碱）、黄酮类（杜鹃素）、木质素类（丁香脂素）共13 个有效成分的含量，并采用箱线图对不同批次痛安注射液中的13个有效成分进行质量分析，结果表明所建立的分析方法稳定、快速、准确、可靠，可为痛安注射液质量标准的提升提供一定的科学依据。

1 材料

AB API4000+质谱仪（美国 AB 公司），配有三重四极杆线性离子阱质量分析器，Toubo V 电喷雾离子源；LC-30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有四元泵，自动进样器，二极管阵列检测器和真空脱气机；CHA-S型气浴恒温振荡器（国华仪器）；HSC-24A型氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；METTLER XS 205微量分析天平（梅特勒-托利多，瑞士-美国）；ST-16R型高速冷冻离心机（Thermo Fisher）；XW-80A型微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；KQ-500 台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，中国）；甲醇为色谱纯 （Fedia company.Inc.1000 Fedia way）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司，中国），其余试剂均为分析纯。

对照品N-反式阿魏酰酪胺（批号 140721，纯度≥98%）、血根碱（批号 14082303，纯度≥98%）、白屈菜碱（批号 150706，纯度≥98%）、木兰花碱（批号 151029，纯度≥98%）、别隐品碱（批号150118，纯度≥98%）、原阿片碱（批号 151117，纯度≥98%）、杜鹃素（批号 150115，纯度≥98%）对照品均为成都普菲德生物技术有限公司提供，二氢血根碱（批号 W24M7Z11739，纯度≥98%）、黄连碱（批号 16043033，纯度≥98%）对照品购自上海源叶生物科技有限公司；丁香脂素（批号 BBBP00152，纯度98%）购自云南西力生物生物技术有限公司；次罂粟碱（批号 00019368-326，HPLC≥98%）购自ChromaDex，Inc.；白屈菜红碱（批号 111718-201402，供含量测定用，以80.5%计）、青藤碱（批号 110774-200507，供含量测定用，以100%计）购自中国食品药品检定研究院。10批痛安注射液（江苏康缘药业股份有限公司生产，批号140601，140706，140823，140903，141025，141115，141216，140309，140407，140520）。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-Aq C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色谱柱，流动相0.1%甲酸水溶液 （A）-乙腈 （B），梯度洗脱 （0.01～2 min，5%B；2～8 min，5%～30%B；8～11 min，30%～95%B；11～13 min，95%B；13～13.1 min，95%～5%B；13.1～14 min，5%B），流速0.5 mL·min^-1，柱温 25 ℃，进样量 1 μL。

2.1.2 质谱条件 采用ESI 源，正离子模式检测，喷雾电压为 4 500 V，离子源温度 500 ℃，雾化气 （GS1，N2），压力为 344.74 kPa；辅助气 （GS2，N2） 压力为 344.74 kPa；气帘气 （N2） 压力为206.85 kPa。接口加热，全程通入氮气，多反应离子监测模式 （MRM） 定量。13个化合物测定的离子对，去簇电压 （DP） 和碰撞能量 （CE） 见表 1。13 个化合物的提取离子流色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取痛安注射液2.00 mL，精密量取，置250 mL的量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，取以 14 000 r·min^-1离心 10 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液 分别取丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱对照品适量，精密称定，置 25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度分别为 0.205 6，0.158 8，0.087 2，1.960 0，0.132 0，0.106 0，0.207 6，0.230 0，0.200 4，0.214 0，0.187 2，0.209 2，0.207 6 g·L^-1的对照品储备液，避光4 ℃保存。分别精密量取适量的上述标准储备液，由50%甲醇定容，配制成系列浓度的标准工作溶液，需现用现配，13 种混合对照品溶液均由储备液稀释得到。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取混合对照品储备液1 mL，置于25 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀，作为混合对照品储备液，按倍率稀释法用50%甲醇稀释配制成一系列浓度的混合对照品溶液。进样前用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，按2.1项方法测定峰面积，以进样浓度 （x） 为横坐标，峰面积 （y） 为纵坐标进行线性回归，分别以信噪比为 10和 3 时各对照品的量作为定量限 （LOQ） 和检测限 （LOD）。 13 个待测组分的进样浓度和峰面积的相关系数 r 均大于 0.999 0，见表 2。

2.3.2 定量限和检测限 取混合对照品溶液，依次稀释成梯度质量浓度溶液，按照2.1.1和2.1.2项的条件进行分析测定，以信噪比10倍和 3 倍时的质量浓度为定量限和检测限，见表2。

2.3.3 精密度试验 取痛安注射液（140601），按2.2.1项方法制备供试品溶液，按照2.1.1和2.1.2项的条件平行连续进样分析6次，分别记录各成分峰面积，计算RSD，结果显示RSD均小于2.1%，均符合精密度试验要求，说明该仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取痛安注射液（140601），按2.2.1项方法制备供试品溶液，按照2.1.1和2.1.2项的条件进样分析，分别于 0，2，4，8，16，24 h 时间点进样，计算各成分峰面积的 RSD，各成分均小于2.8%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.3.5 重复性试验 取痛安注射液（140601），按2.2.1项方法制备供试品溶液 6 份，按照 2.1.1和 2.1.2项的条件进样测定，记录 13个化合物的峰面积，计算 RSD。结果测定供试品溶液中丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱含量的平均值 （n=6）质量浓度分别为0.026 0，0.001 7，0.001 3，6.081 3，0.221 3，0.002 7，0.785 1，0.074 8，0.094 9，0.420 1，0.015 7，0.808 8，0.009 1 g·L^-1，RSD均小于1.9%。均符合规定，表明方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密量取同一批次 （批号140601）的痛安注射液1.00 mL，加入混合对照品溶液1.00 mL（丁香脂素0.050 g·L^-1、N-反式阿魏酰酪胺0.003 6 g·L^-1、白屈菜红碱0.002 4 g·L^-1、青藤碱 12.200 g·L^-1、黄连碱0.463 g·L^-1、血根碱0.005 g·L^-1、白屈菜碱 1.603 g·L^-1、木兰花碱 0.160 g·L^-1、别隐品碱 0.179 g·L^-1、原阿片碱 0.830 g·L^-1、杜鹃素0.040 g·L^-1、次罂粟碱1.642 g·L^-1、二氢血根碱0.020 g·L^-1，在此储备溶液基础上稀释一倍作为混合对照品溶液），按2.2.1项方法制备供试溶液，进样分析，并作随行标准曲线计算回收率，结果见表3。

2.4 样品测定

精密量取 10 个不同批次痛安注射液成品，按照 2.2.1项方法制备供试品溶液，每个批次的样品平行制备3份供试品溶液，按照 2.1.1和 2.1.2项的条件进样测定，带入线性回归方程分别计算痛安注射液中 13 个成分含量，结果见表 4。

2.5 箱线图分析

箱线图是一种描述数据分布的统计图，利用它可以直观的来观察变量值的分布情况，箱线图主要表示变量值的中位数，1/4位数，3/4位数等统计量。在现有的研究基础上，引入了P来评价批次间的差异，P=CA/CB×100，其中CA为每个批次各个化合物的测定浓度，CB为10个批次各个化合物的平均测定浓度。P越接近于100%表明批次间的差异越小，规定批次间的波动在75%～125%是可以接受的[7]。采用 SPSS 20.0 数据处理软件对测定结果进行处理，对痛安注射液10批次中的13个化学成分进行分析，见图2。化合物4与12分别有一个异常值。由此可以得出不同批次痛安注射液的质量并无明显差异，从而为痛安注射液的质量控制提供依据。

3 讨论

3.1 测定方法的选择

目前对于痛安注射液中化学成分的测定，多采用高效液相色谱测定，要求各种成分色谱峰完全分离，分析时间较长，且对于含量较少，色谱分离度低的化合物无法快速准确测定。前期对痛安注射液有效成分含量测定的报道，多集中于其中2个或几个成分的测定，其余有效成分的含量测定方法还未建立[8-9]。本课题组前期运用现代化学-药理学相结合的方法对痛安注射液进行了系统的化学成分分析研究，分离鉴定了21个化合物，并采用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型对所分离到的21化合物进行了PGE2抑制活性检测，发现丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱对PGE2有很好的抑制作用。本研究通过对离子扫描模式的摸索，发现这13个化合物在正离子扫描模式下响应高，峰形好，故本研究采用多反应离子监测模式，同时测定痛安注射液中 13个有效成分含量。由于质谱采用单离子扫描模式，樣品中其他物质对待测成分干扰小，且色谱分离度对检测影响不大，可以在短时间内实现有效分离。

3.2 流动相的选择

流动相中的有机相一般可选用甲醇或乙腈，13个化合物中11个化学成分为生物碱，而生物碱成分均含有N 原子，呈弱碱性，对pH较敏感，pH较低时会以结合状态存在，pH较高时会以游离状态存在，所以流动相中的pH 要达到一定的酸度，使生物碱以一种状态形式存在，才会获得良好的峰形，故在流动相中加入适量甲酸，有助于[M+H]+的形成，可提高响应，改善峰形，试验考察了0，0.05%，0.1% 的甲酸水溶液对于分析物的响应及峰形的影响，发现0.1%甲酸水溶液峰形最好，考虑到色谱柱的使用寿命，0.1%甲酸水溶液的pH约为4，该色谱柱可以耐受这样的酸度，故采用了0.1%甲酸水溶液。有机相甲醇与乙腈对于峰形的影响不大，并且前期在运用UPLC-Q/TOF-MS方法对痛安注射液定性的研究中有机相采用乙腈[10]，所以本课题组选取了乙腈-0.1%的甲酸水溶液作为流动相。

3.3 定量重复性

根据对常规定量重复性的一般规定RSD≤2.0%，但与UV及HPLC等相比，质谱定量分析灵敏度高，但重复性通常较差，很难达到药物制剂日常定量的要求。因此为保证本方法定量重复性应保证仪器状态稳定，操作规范，减少操作误差；选择合适的离子对，响应好；在允许范围内，尽量提高样品浓度。

4 小结

本实验采用 LC-MS/MS以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，14 min即可快速分离痛安注射液中13个有效成分，该方法简单、灵敏、准确，可为该药的全面质量控制提供科学依据。该方法的精密度、稳定性、重复性及回收率均较好，耗时短，同时分析13个成分，并且其中最小的檢测限为0.048 462 mg·L^-1，可用于含量较低的活性成分的相关研究，有利于进一步完善痛安注射液及其类方的质量控制及相关研究。

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[责任编辑 孔晶晶]