利用风味蛋白酶制备蚕蛹蛋白多肽的工艺研究

李兴 李冰 夏家凤 刘健 范涛

(安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥230061)

利用风味蛋白酶制备蚕蛹蛋白多肽的工艺研究

李兴 李冰 夏家凤 刘健 范涛

(安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥230061)

蚕蛹蛋白是一种优质蛋白资源，蚕蛹蛋白多肽分子量更小，可广泛应用于食品、保健品。以裸蛹家蚕一代杂交种的新鲜、无污染的蚕蛹为研究基础材料，通过有机溶剂提取的方法脱脂后得到蚕蛹粗蛋白，选择市场价格低廉、反应条件温和、酶解产物品质高的风味蛋白酶酶解蚕蛹蛋白，制备蚕蛹蛋白多肽。通过单因素和正交试验确定了蚕蛹蛋白酶解制备蚕蛹蛋白多肽的最佳工艺条件:酶解温度50℃，酶解时间4 h，料液质量浓度111 g/L，酶解液pH值6.0，酶用量750 U/g，此条件下水解度(DH)达到30.12%。

蚕蛹;蛋白多肽;风味蛋白酶;酶解;工艺优化

蚕蛹具有较高的营养价值，一直作为滋补强身、活血脾胃的食物和药物［1］。现代科学试验证明，蚕蛹中含有丰富的营养成分，蚕蛹粉中含55%～60%的粗蛋白、25%～30%的粗脂肪、3%～5%的糖、2%～3%的壳聚糖等有效成份，还含有多种微量元素等［2］;蚕蛹蛋白是纯天然全价蛋白质，其人体必需氨基酸与非必需氨基酸的比例符合世界卫生组织/联合国粮食及农业组织(WHO/FAO)提出的参考蛋白模型，是一种理想的优质蛋白［3］。通常每生产1.0 t生丝可以获得1.0 t干蚕蛹，而目前蚕蛹主要用于饲料加工和粗蛋白提取等附加值较低的用途，造成了极大的浪费［4］。随着科学技术的进步和人们对蚕蛹蛋白认识的加深，蚕蛹蛋白的综合利用将越来越受到人们的重视［5］。而且近些年来，随着中国社会老龄化的加剧，市场对氨基酸及其衍生物的需求量也逐年加大，特别是作为更易被人体吸收的蚕蛹蛋白多肽具有广阔的市场发展前景，相关开发与利用技术也成为学者研究的热点。熊燕飞等［6］采用酶解法对蚕蛹蛋白进行酶解，经胰蛋白酶处理后酸溶性多肽的得率为92.37%，将制取得到的蚕蛹蛋白多肽应用到食品中，可增加食品的营养性。陈静等［7］以超临界提取油脂后的蚕蛹蛋白粉为原料，采用碱性蛋白酶酶解制备蚕蛹蛋白多肽，通过正交试验确定了蚕蛹蛋白酶解制备蚕蛹蛋白多肽的最佳工艺条件，并研制了能够缓解疲劳的蚕蛹蛋白多肽运动饮料。张海娜［8］选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶等5种蛋白酶对脱脂处理后的蚕蛹蛋白进行双酶解效果实验，得到以碱性蛋白酶和复合蛋白酶双酶解制备出的蚕蛹活性多肽对血管紧张素转化酶(ACE)抑制率最高，达到38.09%，同时利用响应面优化法得到最佳的酶解条件。

前人对制备蚕蛹蛋白多肽的研究大多是利用经过高温蒸煮、碱水浸泡后的缫丝下脚料蚕蛹，此类蚕蛹已受到一定程度的污染，而随着人们对食品原料要求标准的提高，缫丝下脚料蚕蛹将无法达到人们对健康、绿色食品的要求［9］。同时，虽然水解酶大多选择效率高，但胰蛋白酶、碱性蛋白酶等酶解效率高的酶类多需在苛刻的pH值、温度环境中进行，而且市场售价高，难以应用于生产实践。家蚕裸蛹是一种自然突变产生的性状变异，产少量或不产丝胶，并能稳定遗传［10］，其一代杂交种具有裸蛹性状，同时兼有抗逆性好、蛹体大等优势，是一种获得天然、无污染蚕蛹的良好素材［11］。风味蛋白酶是利用米曲霉发酵，经先进的提取工艺微滤、超滤浓缩、干燥技术精制而得，再添加一些风味物质，筛选复配而成，风味蛋白酶天然安全，可应用于各种动植物蛋白的酶解，后期风味优化，去除苦味，改善口感，应用风味蛋白酶可以制取风味良好的动植物酶解产品，提高产品质量，降低成本。在食品加工过程中添加合适的风味蛋白酶，使风味前体物酶解，从而释放出风味物质，增强和改善食品的风味［12］。本文以天然裸蛹家蚕一代杂交种蚕蛹为研究基础材料，利用有机溶剂提取油脂后的蚕蛹蛋白粉为原料，选用市场价格低廉、反应条件温和、酶促反应相对较好的风味蛋白酶制备蚕蛹蛋白多肽，并通过正交试验确定了酶解制备蚕蛹蛋白多肽的最佳工艺条件，为工业化生产天然、无污染的蚕蛹蛋白多肽提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蚕蛹:由安徽省农业科学院蚕桑研究所保存的裸蛹家蚕品种Nd和实用性品种Z18的一代杂交种经常规饲育，上蔟第6天后所得的天然蚕蛹。

主要试剂:风味蛋白酶(15 000 U/g)，上海生工生物工程有限公司产品;正己烷(分析纯)，莱阳经济技术开发区精细化工厂产品;丙酮(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、石油醚(分析纯)、硫酸铜(CuSO4· 5H2O)、硫酸钾(K2SO4)，国药集团化学试剂有限公司产品;盐酸(HCl)，淄博硕营化工销售有限公司产品。

主要仪器与设备:TP－500索氏提取器，金坛富华仪器有限公司产品;DH6－924385－III型电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司产品; LABOROTA400旋转蒸发器，德国Heidoph公司产品;FW100高速万能粉碎机、S212恒速搅拌器，上海精宏实验设备有限公司产品;DZKW－S－4型恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂产品;FA2004电子天平，上海天平仪器厂产品;PHS－3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司产品;SHZ－82振荡水浴锅，上海仪纯实业有限公司产品;5430R离心机，Eppendorf公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 蚕蛹粗蛋白的制备将试验蚕蛹置于60℃的烘箱里恒温干燥12 h以上，至恒质量，用粉粹机粉碎，过60目筛，得到蚕蛹粉备用。采用参考文献［13］的方法，定量称取上述蚕蛹粉，用裁剪成长方形的脱脂滤纸包成圆柱形，置于索式提取器筒内，加入2/3索式提取器体积的正己烷，连接好接收瓶，置于70℃恒温水浴锅中进行加热回流5～8 h，结束后将滤纸包取出并置于通风厨中，待有机溶剂挥发后，置于60℃恒温烘箱中烘干至质量不变，去除滤纸，即得到去除蛹油的蚕蛹粗蛋白，所制得的蚕蛹粗蛋白继续用于后续风味蛋白酶酶解试验，工艺流程如图1所示。

图1 蚕蛹蛋白多肽的加工流程

1.2.2 指标测定采用参考文献［14］指标测定的方法，准确称取一定量的蚕蛹粗蛋白按设定的底物浓度加入一定量的水。用1 moL/L NaOH溶液调节至所需pH值，加热至85℃保持20 min后冷却至40℃以下，然后加入蛋白酶，在保持一定pH值及温度条件下酶解。酶解结束后煮沸10 min灭酶，冷却后12 000 r/min离心10 min，取上清液。沉淀用适量蒸馏水洗涤1次并12 000 r/min离心10 min，合并上清液，记录体积。蚕蛹蛋白酶解液中氨基酸态氮含量采用甲醛滴定法测定，蚕蛹蛋白质量分数采用微量凯氏定氮法测定(蛋白质换算系数6.25)［15］。

1.2.3 水解度(DH)的计算

式中:N为酶解液中氨基酸态氮的含量，单位g/mL; V为酶解液的体积，单位mL;G为脱脂蚕蛹粉的质量，单位g;P为脱脂蚕蛹粉蛋白质的质量分数，单位%;6.25为蛋白质换算系数［14］。

1.2.4 蚕蛹蛋白酶解工艺的单因素试验以脱脂后的蚕蛹粗蛋白为原料，以水解度为指标，采用风味蛋白酶酶解法制备蚕蛹蛋白多肽，通过单因素试验对酶解温度、酶解液pH值、料液质量浓度、酶用量、酶解时间等对蚕蛹蛋白酶解作用影响较大的5个关键因素进行考察。分别以不同温度(35、40、45、50、55、60℃)，不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，不同料液质量浓度(250、200、167、143、125、111 g/L)，不同酶用量(150、300、450、600、750、900 U/g)，不同酶解时间(1、2、3、4、5、6 h)做单因素试验，每个试验重复3次。

1.2.5 蚕蛹蛋白酶解工艺的正交试验在单因素试验的基础上，以酶解温度、酶解液pH值、料液质量浓度、酶用量、酶解时间5个因素进行正交试验，以蛋白水解度为参考指标，通过L16(45)正交试验设计，试验结果利用正交设计助手软件进行分析，确定风味蛋白酶酶解蚕蛹蛋白的最佳工艺条件，因素水平见表1。

表1 蚕蛹蛋白酶解工艺条件L16(45)正交试验因素水平设计

1.2.6 最佳工艺的验证为进一步考察正交分析所得最佳工艺的科学性和稳定性，按照优化的最佳工艺条件经过重复性试验3次，并分别测定蚕蛹蛋白水解度，计算其相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解温度对蚕蛹蛋白水解度的影响称取5 g蚕蛹粗蛋白，设定酶解液PH值为7.0，料液质量浓度为143 g/mL，酶用量为600 U/g，酶解时间为3 h的条件，在不同酶解温度(35、40、45、50、55、60℃)下对蚕蛹蛋白进行酶解，根据1.2.3中蛋白水解度的测定方法对不同温度下蚕蛹蛋白的水解度进行测定，结果如图2所示。

图2 酶解温度对蚕蛹蛋白水解度的影响

从图2可以看出，随着温度的升高，蚕蛹蛋白水解度逐渐增加，在50℃的时候达到最大值，之后随着温度的增加，水解度又逐渐下降，这说明在50℃时，风味蛋白酶活性达到最大值，高于或低于这个温度，活性都下降。所以后续正交试验选择50℃上下的4个梯度值(40、45、50、55℃)进行试验。

2.1.2 酶解液pH值对蚕蛹蛋白水解度的影响称取5 g蚕蛹粗蛋白，设定酶解温度为50℃，料液质量浓度为143 g/L，酶用量为600 U/g，酶解时间为3 h的条件，在不同酶解液pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)下对蚕蛹蛋白进行酶解，根据1.2.3中蛋白水解度的测定方法对不同pH值下蚕蛹蛋白的水解度进行测定，结果如图3所示。

图3 酶解液pH值对蚕蛹蛋白水解度的影响

从图3可以看出，风味蛋白酶的最适酶解液pH值为6.5，此时蚕蛹蛋白水解度达到最大值，低于或高于该pH值，均使风味蛋白酶的水解效率降低，所以后续正交试验选择pH值为6.5上下的4个梯度值(6.0、6.5、7.0、7.5)进行试验。

2.1.3 料液质量浓度对蚕蛹蛋白水解度的影响称取5 g蚕蛹粗蛋白，设定酶解温度为50℃，酶解液pH值为7.0，酶用量为600 U/g，酶解时间为3 h的条件，在不同料液质量浓度(250、200、167、143、125、111 g/L)下对蚕蛹蛋白进行酶解，根据1.2.3中蛋白水解度的测定方法对不同料液质量浓度下蚕蛹蛋白的水解度进行测定，结果如图4所示。

图4 料液质量浓度对蚕蛹蛋白水解度的影响

从图4可以看出，在设定的条件下，蚕蛹蛋白和溶剂水的料液质量浓度为143 g/L时，风味蛋白酶酶解效率最高，此时蚕蛹蛋白水解度最大。当料液质量浓度低于143 g/L时，可能是因为蚕蛹蛋白还未完全溶于水，溶液已达到饱和状态，这时的水解效率是由溶剂的量所决定的。当料液质量浓度高于143 g/L时，溶剂的增加降低了酶的浓度，使反应效率下降。所以后续正交试验选择料液质量浓度143 g/L左右的4个梯度值(167、143、125、111 g/L)进行试验。

2.1.4 酶用量对蚕蛹蛋白水解度的影响称取5 g蚕蛹粗蛋白，设定酶解温度为50℃，酶解液pH值为7.0，料液质量浓度为143 g/L，酶解时间为3 h的条件，在不同酶用量(150、300、450、600、750、900 U/ g)下对蚕蛹蛋白进行酶解，根据1.2.3中蛋白水解度的测定方法对不同酶用量下蚕蛹蛋白的水解度进行测定，结果如图5所示。

从图5可以看出，在设定的条件下，随着风味蛋白酶用量的增加，蚕蛹蛋白水解度在增加，但当酶用量达到750 U/g时，水解度已趋于最大值，酶量再增加时水解度增加不明显。为了节约成本，所以后续正交试验选择风味蛋白酶用量750 U/g以下的4个梯度值(300、450、600、750 U/g)进行试验。

图5 酶用量对蚕蛹蛋白水解度的影响

2.1.5 酶解时间对蚕蛹蛋白水解度的影响称取5 g蚕蛹粗蛋白，设定酶解温度为50℃，酶解液pH值为7.0，底物质量浓度为143 g/L，酶用量600 U/g的条件，在不同酶解时间(1、2、3、4、5、6 h)下对蚕蛹蛋白进行酶解，根据1.2.3中蛋白水解度的测定方法对不同酶解时间下蚕蛹蛋白的水解度进行测定，结果如图6所示。

图6 酶解时间对蚕蛹蛋白水解度的影响

从图6可以看出，在设定的条件下，随着酶解时间的延长，蚕蛹蛋白水解度在增加，当酶解时间为3 h时，蛋白水解度已趋于最大值，再延长酶解时间蛋白水解度增加不明显。为了提高提取效率，后续正交试验选择酶解时间4 h左右的4个梯度值(2、3、4、5 h)进行试验。

2.2 蚕蛹蛋白最佳酶解工艺的确定

为优化酶解条件，在单因素试验的基础上，采用L16(45)正交试验，以水解度为指标，确定蚕蛹蛋白最佳酶解工艺，结果如表2所示。由表2极差分析可得，影响酶解反应的主次关系为A＞E＞D＞C＞B，说明在蚕蛹蛋白酶解过程中影响水解度的主要因素是酶解温度，然后是酶解时间、酶用量、料液质量浓度和酶解液pH值。根据表2中各因素的K值大小可以确定各因素的较优水平组合是A3B1C4D4E3，正交试验中无此方案，通过验证试验确定蚕蛹蛋白酶解最佳的工艺参数为酶解温度50℃、酶解时间4 h、料液质量浓度111 g/L、酶解液pH值6.0、酶用量750 U/g，在此条件下水解度为30.97%。

表2 蚕蛹蛋白酶解工艺条件的正交试验结果

2.3 正交试验优化验证

采用正交试验所得最佳提取工艺在酶解温度50℃，酶解时间4 h，料液质量浓度111 g/L，酶解液pH值6.0，酶用量750 U/g进行3次重复试验，从试验结果得出在该条件下蚕蛹蛋白水解度平均可达到30.12%，说明经过正交试验筛选出来的提取条件科学合理，结果稳定可靠，具有较好的重复性。

3 小结与讨论

进行蚕蛹蛋白酶解技术的研究与开发，生产蚕蛹蛋白多肽创新产品，不仅可提高蚕桑产业的附加值和比较效益，也丰富了我国氨基酸产品的消费市场。且随着科技的发展，人们对蚕蛹蛋白的研究将更加深入，将在食品、医药、化工、农业等行业不断开发出更多应用［16］，蚕蛹蛋白多肽产业大有可为。

本文以天然裸蛹家蚕一代杂交种(Nd×Z18)的蚕蛹为研究基础材料，利用有机溶剂提取油脂后的蚕蛹蛋白粉为原料，采用市场价格低廉、反应条件温和、酶促反应相对较好的风味蛋白酶制备蚕蛹蛋白多肽，并通过正交试验确定了蚕蛹蛋白酶解的最佳工艺条件，在酶解温度50℃，酶解时间4 h，料液质量浓度111 g/L，pH值6.0，酶用量750 U/g的最优条件下，蚕蛹蛋白的水解度可达到30.12%。为工业化生产天然、无污染的蚕蛹蛋白多肽提供了参考，同时也为提高蚕业附加值、构建蚕业非绢丝产业链［17］提供了解决思路。

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S886.9

A

1007－0982(2017)02－0012－06

10.16839/j.cnki.zgcy.2017.02.003

2017－02－28;接受日期:2017－03－28

安徽省农业科学院学科建设项目(编号16A0619、17A0617);现代农业产业技术体系建设专项(编号CARS－22)。

信息:李兴(1984—)，男，安徽桐城，硕士，副研究员。Tel:0551－62826593，E-mail:ahcss@sohu.com

信息:范涛(1962—)，男，安徽太和，硕士，研究员。Tel:0551－66826686，E-mail:fantao1116@163.com