离子色谱法测定啤酒中6种无机阴离子的含量

刘珍珠，张辉珍，崔 鹤，赵海峰，邱阿敏

（1.青岛大学公共卫生学院，青岛266071； 2.青岛市食品药品检验研究院，青岛266071；3.青岛检验检疫技术发展中心，青岛266002）

离子色谱法测定啤酒中6种无机阴离子的含量

刘珍珠1，张辉珍2＊，崔 鹤3，赵海峰2，邱阿敏1

（1.青岛大学公共卫生学院，青岛266071； 2.青岛市食品药品检验研究院，青岛266071；3.青岛检验检疫技术发展中心，青岛266002）

取啤酒样品（10.0mL）超声脱气30min，用经活化的固相萃取小柱净化。收集净化液2.0mL，用水稀释至20.0mL。所得样品溶液经0.22μm滤膜过滤后，直接进样进行离子色谱分析。采用阴离子交换柱IonPac AS11作为分离柱，用氢氧化钾淋洗液发生器产生的不同浓度的氢氧化钾溶液作梯度淋洗，流量为1.0mL·min－1，柱温为35℃。6种无机阴离子（Cl－、NO2－、Br－、NO3－、SO42－、PO43－）在一定质量浓度范围内呈线性，检出限（3S／N）在0.005～0.028mg· L－1之间。对同一个啤酒样品进行精密度试验，测定值的相对标准偏差（n＝6）在2.1%～3.0%之间。按标准加入法进行回收试验，回收率在89.0%～105%之间。

离子色谱法；啤酒；无机阴离子

啤酒酿造的主要原料是酿造水、麦芽、啤酒花、酵母等，啤酒中的氯离子、硫酸根、硝酸根主要来源于原料和加工助剂［1－2］，无机阴离子的含量高低不仅会影响成品啤酒的风味和口感，而且会对啤酒的饮用安全产生影响。氯离子能够赋予啤酒醇厚、丰满的口味，但过量的氯化物会使咸味增加。硫酸盐可以提高酒花香气，能赋予啤酒以淡及苦的风味，而过量的硫酸盐会使啤酒产生苦、涩、酸的味道［3］。高浓度的硝酸盐在亚硝化细菌的作用下会转化成亚硝酸盐，损害酵母代谢造成不完全发酵［4］，同时过量的亚硝酸盐进入体内可导致组织缺氧，此外，亚硝酸盐可与食物或胃中的仲胺类物质发生反应生成亚硝胺，有强烈的致癌作用。磷酸盐是体液的重要成分，维持体压的稳定，磷酸盐过量会导致体内压过高。建立一种可靠的分析方法对啤酒的原料、生产过程以及成品中无机阴离子的含量进行监测十分必要。

目前离子色谱法已经广泛应用于水质、食品、药物、能源等方面的分析［5－8］。离子色谱法用于啤酒中无机阴离子的分析也有报道［9－12］，淋洗液多采用氢氧化钠或碳酸钠与碳酸氢钠的混合溶液，由于啤酒中含有多糖、有机酸、醇类、醛类、水溶性蛋白、色素、酵母等多种化合物［13］，以往的文献中，大多采用水稀释滤膜过滤后直接进样，受离子色谱柱的分离能力的限制，阴离子与有机酸、醇类、小分子糖类等化合物往往不能完全分离，使定量结果的可信度不高。而且，膜过滤直接进样不能有效去除色素、水溶性蛋白等大分子有机物，批量测定时会造成离子交换色谱柱堵塞、分离度下降。本工作采用固相萃取技术，优化了前处理条件，采用阴离子交换柱、抑制电导检测器，自动淋洗液发生器梯度洗脱，离子色谱法测定啤酒中6种阴离子（Cl－、NO2－、Br－、NO3－、SO42－、PO43－）的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ICS－2100型离子色谱仪，配单元泵、淋洗液发生器、AERS500－4mm型抑制器、恒温电导检测器、自动进样器和Chromeleon色谱工作站；Milli－Q型纯水机；Carb固相萃取小柱（500mg／3mL），C18固相萃取小柱（500mg／6mL），HLB固相萃取小柱（500mg／3mL）。

试验用水为超纯水，其电阻率为18.2MΩ· cm。

1.2 仪器工作条件

IonPac AS11－HC型分离柱（250mm×4mm），IonPac AG11－HC型保护柱（50mm×4mm），柱温35℃；电导池温度35℃；抑制器电流75mA；淋洗液为氢氧化钾溶液（由自动淋洗液发生器产生），流量1.0mL·min－1，进样量25μL。梯度淋洗程序：0min时，5mmol·L－1氢氧化钾溶液，保持3min；3.0～15.0min，氢氧化钾溶液浓度由5mmol·L－1升至15mmol·L－1；15.1～25.0min，氢氧化钾溶液浓度由15mmol·L－1升至30mmol·L－1；25.1～30.0min，氢氧化钾溶液浓度由30mmol· L－1升至55mmol·L－1；30.0～30.1min，氢氧化钾溶液浓度由55mmol·L－1跳转至5mmol·L－1，保持5min。

1.3 试验方法

依次用甲醇5mL、水5mL活化Carb固相萃取小柱。将啤酒样品超声脱气30min，取10.0mL样品过活化后的Carb固相萃取小柱，弃去前5mL流出液，收集随后的2.0mL流出液，用水稀释10倍，过0.22μm水相尼龙滤膜，按仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按试验方法测定阴离子混合标准溶液和啤酒样品的色谱图见图1。

图1 混合标准溶液及啤酒样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution and beer sample

2.2 样品前处理方式的选择

由于啤酒样品中成分复杂，含有多糖、蛋白、色素等大分子有机物杂质，采用合适的前处理方式去除这些物质，既是对色谱柱的保护，也可使各组分得到较好分离。试验比较了Carb柱、C18柱、HLB柱等3种固相萃取小柱对大分子有机物的脱除效果。Carb柱吸附剂为石墨化炭黑，非极性保留机制，可以去除样品里的色素和部分糖类、蛋白等有机物质；其填料外表面是羟基化的，可以被水浸湿，对液体样品具有很好的流通性；聚合物表面的极性梯度使得小分子物质被推向疏水性更强的内核，因此吸附性能良好。C18柱吸附剂为硅胶，可以去除样品里的一些有机物。HLB柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N－乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，与C18柱吸附的杂质类似，但比C18柱吸附容量大。试验结果发现：Carb柱对啤酒中色素、蛋白、多糖等有机化合物的脱除效果较好，且对所检测的无机阴离子没有吸附。若直接进样200次后，IonPac AS11－HC的柱压升高了3 999kPa，理论塔板数由24 412下降为14 647，柱效下降了40%；若用Carb柱处理后再进样，500次进样后，柱压仅升高了1 448kPa，柱效下降小于10%，延长了分离柱的寿命。试验选择Carb固相萃取小柱进行样品的前处理。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱

淋洗离子OH－是一种非常易水合的离子，容易进入固定相的水合区，能有效地从离子交换位置上置换其他阴离子［14］。IonPac AS11柱的离子交换功能基是烷醇季铵基，亲水性较强，对OH－选择性强，在无机阴离子及有机酸分析方面应用广泛［14－15］。IonPac AS15柱为疏水性很强的阴离子交换柱，对有机酸具有较强的保留，由于啤酒中含有多种有机酸，与IonPac AS11柱相比，IonPac AS15柱分离所需时间长。试验选用IonPac AS11柱对啤酒中的无机阴离子进行分离。

2.3.2 梯度淋洗程序

以氢氧化钾溶液为淋洗液，由于高价态的离子比低价态的离子在固定相上的保留性强，需要进行梯度洗脱。啤酒中存在多种有机酸，在考虑无机阴离子分离的同时，也需要考虑将无机阴离子与有机酸很好地分离。当淋洗液氢氧化钾溶液浓度为5～15mmol·L－1时，Cl－能与NO2－、一元有机酸很好地分离开；当淋洗液氢氧化钾溶液浓度为15～30mmol·L－1时，在有机酸不干扰阴离子出峰的前提下，Br－和NO3－能很好地分离；当淋洗液氢氧化钾溶液浓度为30～55mmol·L－1，使PO43－洗脱，且使柠檬酸等有机酸快速流出色谱柱。梯度淋洗程序见1.2节。在优化的梯度淋洗程序下，阴离子与有机酸可以得到良好分离，分离时间短，见图2。

图2 无机阴离子与有机酸的色谱图Fig.2 Chromatogram of inorganic anions and organic acids

2.3.3 流量和柱温

流量和柱温对分离的影响主要体现在组分的保留时间及峰形上，最佳流量应在色谱峰完全分离的前提下尽量缩短保留时间。流量和柱温也会影响系统的压力。当压力在合适范围时，试验考察了流量为0.6，0.8，1.0mL·min－1，柱温为25℃，30℃，35℃，40℃时各组分的分离情况。结果表明：流量为1.0mL·min－1，柱温为35℃时，NO3－与后一未知峰的分离度更好，同时也提高了与前面Br－的分离度，各组分峰分离情况达到最佳。试验选择流量为1.0mL·min－1，柱温为35℃。

2.4 标准曲线与检出限

按仪器工作条件对6种无机阴离子混合标准溶液系列进行测定，以无机阴离子的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。6种无机阴离子的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。将啤酒样品分别稀释一定倍数或添加一定量的阴离子标准，测定10次，按3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N），按10倍信噪比计算测定下限（10S／N），结果见表1。

2.5 精密度试验

取已知不含有NO2－和Br－的啤酒样品超声脱气30min，添加10mg·L－1的NO2－和Br－标准溶液，按试验方法平行测定6次，其测定值的相对标准偏差（RSD）见表2。

表1 线性参数、检出限及测定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表2 精密度试验结果（n＝6）Tab.2 Results of test for precision

由表2可知：测定值的RSD均小于4%，表明方法具有良好的精密度。

2.6 回收试验

取脱气后的啤酒样品6份，分别添加6种无机阴离子标准，按试验方法平行测定6次，加标回收率结果见表3。

表3 回收试验结果（n＝6）Tab.3 Results of test for recovery

2.7 样品分析

按试验方法对不同品种、不同产地的啤酒样品进行测定，结果见表4，其中“－”表示未检出。

由表4可知：各种啤酒中均未检出NO2－，说明啤酒中NO2－的风险较低；一种啤酒中检出Br－，可能与酿造水有关；在各种啤酒中含量较低，其中德国、法国啤酒中未检出含量差别较大，可能与不同啤酒所用酿造水、原料质量以及加工助剂硫酸钙的使用有关在酒花和麦芽中含量较高，啤酒中4含量主要与原料中磷含量以及啤酒中原麦汁含量有关。

表4 啤酒样品分析结果Tab.4 Analytical results of beer samples

本工作提出了测定啤酒中6种无机阴离子的离子色谱法，采用Carb固相萃取小柱进行净化处理，IonPac AS11阴离子交换柱分离，氢氧化钾溶液梯度淋洗，抑制电导检测。该方法操作简单，准确度和精密度较高，适用于啤酒中无机阴离子的测定，对控制啤酒质量、保证饮用安全意义重大。

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Determination of 6Inorganic Anions in Beer by Ion Chromatography

LIU Zhen－zhu1，ZHANG Hui－zhen2＊，CUI He3，ZHAO Hai－feng2，QIU A－min1
（1.School of Public Health，Qingdao University，Qingdao 266071，China；2.Qingdao Institute for Food and Drug Control，Qingdao 266071，China；3.Qingdao Inspection and Quarantine Technology Development Center，Qingdao 266002，China）

Beer sample（10.0mL）was degassed ultrasonically for 30min，and then purified on activated SPE column.2.0mL of the purified solution was diluted with water to 20.0mL，filtered on 0.22μm filtering membrane and the filtrate was used for IC analysis.The anion exchange column IonPac AS11was used for separation with column temperature at 35℃and KOH solutions of various concentrations produced by a KOH eluant generator were used in gradient elution，with flow－rate of 1.0mL·min－1.Linearity ranges for 6inorganic anions（Cl－，NO2－，Br－，NO3－，SO42－and PO43－）were kept between definite mass concentrations.Values of detection limits（3S／N）were in the range of 0.005－0.028mg·L－1.With a same beer sample，test for precision was made，giving values of RSDs（n＝6）in the range of 2.1%－3.0%.Test for recovery was made by standard addition method，giving results in the range of 89.0%－105%.

Ion chromatography；Beer；Inorganic anions

O657.7

A

1001－4020（2017）04－0404－05

10.11973／lhjy－hx201704007

2016－05－09

国家科学仪器设备重大开发专项（2012YQ090229）

刘珍珠（1990－），女，河南安阳人，硕士研究生，主要从事食品营养与安全检测工作。

＊通信联系人。E－mail：13963988819＠163.com