高效液相色谱法测定卡格列净中葡萄糖酸－δ－内酯的含量

董淑波，杨汉跃，严拯宇＊

（1.中国药科大学理学院分析化学教研室，南京210000； 2.江苏德源药业股份有限公司，连云港222000）

高效液相色谱法测定卡格列净中葡萄糖酸－δ－内酯的含量

董淑波1，杨汉跃2，严拯宇1＊

（1.中国药科大学理学院分析化学教研室，南京210000； 2.江苏德源药业股份有限公司，连云港222000）

提出了高效液相色谱－电雾式检测器法（HPLC－CAD）测定卡格列净中葡萄糖酸－δ－内酯（GDL）的含量。优化的色谱条件如下：Thermo Hypersil Gold Aq色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈（9＋1）混合溶液，流量0.5mL·min－1，柱温30℃，进样量10μL；电雾式检测器（CAD）的雾化温度为50℃，载气压力427.5kPa。在上述的色谱条件下，GDL的线性范围为1.05～22.5mg·L－1，GDL的检出限（3S／N）为0.32ng。在3个浓度水平上进行加标回收试验，测得回收率在96.2%～103%之间。供试品加标溶液和对照品溶液在室温条件下放置12h内稳定，测定值的相对标准偏差（n＝7）分别为1.8%，1.3%。

高效液相色谱法；电雾式检测器；葡萄糖酸－δ－内酯；卡格列净

D－葡萄糖酸－δ－内酯（简称葡萄糖酸内酯，GDL）作为凝固剂、酸化剂、改良剂等添加剂广泛应用于食品领域［1－3］。近年来，GDL又被作为医药中间体广泛应用于钠－葡萄糖协同转运体－2（SGLT－2）抑制剂的合成过程中，如强生制药公司的Invokana?（卡格列净，Canagliflozin）、阿斯利康和百时美施贵宝公司的Farxiga?（达格列净，Dapagliflozin）以及勃林格殷格翰制药公司和礼来公司的Jardiance?（恩格列净，Empagliflozin）［46］。卡格列净（CG）是FDA批准的首个SGLT－2抑制剂，用于治疗成年患者的II型糖尿病。作为CG合成的中间体，GDL可能会随着工艺残留至产品中，ICH Q3A规定新原料药中特定杂质的限度一般不得超过0.15%（质量分数）。为了保证CG临床使用的安全性和有效性，针对GDL在CG原料药中允许残留的低限度水平，需要建立一种灵敏度高、选择性好的GDL含量测定的方法。GDL及CG的结构式见图1。

图1 GDL和CG的结构式Fig.1 Structural formulae of GDL and CG

由于GDL为弱紫外吸收化合物，无法用常规的紫外检测器检测。目前报道的测定GDL的方法主要有比色法［7］、酸碱滴定法［8］、紫外分光光度法［9－10］、气相色谱法［11－12］、高效液相色谱示差折光检测器法［13－15］和离子色谱脉冲安培检测器法［16］等。比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、示差折光检测器法的灵敏度较低，且重复性不好；酸碱滴定法专属性较差，测定结果易受酸性物质的干扰；由于GDL对热不稳定，153℃左右即分解，因此采用气相色谱法直接测定GDL容易产生降解影响分析结果，准确性低；也可将GDL使用甲基硅烷衍生化或者乙酰化后采用气相色谱法分离测定，但此类方法前处理相对繁琐；离子色谱脉冲安培检测器无法直接检测GDL，且仪器使用成本较高。

此外，GDL为强极性化合物，其分离相对困难。目前，对GDL的分离主要采用气相色谱法、离子色谱法和高效液相色谱法等。将GDL使用甲基硅烷衍生化或者乙酰化等柱前衍生化后采用气相色谱法以中等毛细管柱分离测定，方法前处理相对繁琐，且GDL保留时间较长。离子色谱法主要采用离子交换色谱柱分离GDL的降解产物葡萄糖酸，无法直接测定GDL的含量。目前应用最多的是高效液相色谱法，采用糖柱、有机酸柱、氨基柱或者C18柱分离待测物。强极性化合物在普通C18柱上几乎不保留，测定时受溶剂或其他强极性物质的干扰较大；有机酸柱主要用于分离GDL的降解产物葡萄糖酸，且GDL与葡萄糖酸的分离效果并不理想；糖柱、氨基柱等柱流失严重，在使用过程中理论板数下降较快，使用寿命较短；虽然氨基柱改良为聚合型填充材料，但同规格的聚合型氨基柱与键合型氨基柱相比，柱效明显下降。鉴于以上原因，开发一种操作简便、灵敏度高、选择性好的快速直接分离测定GDL含量的方法具有重要的意义。

本工作采用高效液相色谱法测定卡格列净中葡萄糖酸－δ－内酯的含量，以极性包埋C18键合相的固定相为色谱柱（Thermo Hypersil Gold Aq，250mm×4.6mm，5μm），配合电雾式检测器（CAD）对GDL进行分离和测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo UltiMate 3000型高效液相色谱仪，配HPG 3400SDN型泵（含内置脱气机），WPS 3000TSL ANALYTICAL型自动进样器，TCC 3000RS型柱温箱；DAD 3000型二极管阵列检测器；Thermo Corona Ultra型电雾式检测器（CAD）；Chromeleon 7.2SR4色谱数据工作站。

GDL对照品储备溶液：150mg·L－1，称取GDL 15.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL。

GDL对照品溶液：15mg·L－1，移取GDL对照品储备溶液1.00mL，用甲醇定容至10mL。

D－葡萄糖酸－δ－内酯（纯度不小于99.9%）；乙腈、甲醇为色谱级；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Thermo Hypersil Gold Aq色谱柱（250mm× 4.6mm，5μm），流动相为乙腈（9＋1）混合溶液，流量0.5mL·min－1，柱温30℃，进样量10μL；CAD的雾化温度50℃，氮气压力427.5kPa。

1.3 试验方法

称取CG试样100.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成供试品溶液，按仪器工作条件进行测定。以15mg·L－1GDL溶液为对照品，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 检测器的选择

通用型检测器特别适用于无紫外吸收或弱紫外吸收化合物的检测。CAD为一款通用型检测器，其响应不依赖于化合物的结构，只要待测物不具有挥发性，在色谱柱中能被完全分离，都可以通过电雾式检测器进行分析，并且CAD与蒸发光散射检测器（ELSD）、示差折光检测器（RI）等通用型检测器相比，具备灵敏度高的特点［17－18］。GDL为弱紫外吸收化合物［9］，选用常规的紫外检测器无法实现微量样品的准确定量。试验选择CAD测定GDL的含量。

2.2 色谱柱的选择

氨基柱是分离糖类化合物较为常用的色谱柱［19－20］，试验首先选择氨基柱考察GDL和CG的分离情况，以含0.1%（体积分数，下同）甲酸的甲醇溶液为流动相，流量为1.0mL·min－1，比较了键合型氨基柱（Ultimate XB－NH2，250mm×4.6mm，5μm）和聚合型氨基柱（Shodex Asahipak NH2P－50 40E，250mm×4.6mm，5μm）对GDL和CG分离的影响，见图2。

图2 两种氨基柱对GDL和CG分离的影响Fig.2 Effect of 2kinds of amino columns on separation of GDL and CG

由图2可知：键合型氨基柱的柱效高，分离效果好，但基线噪声较大；聚合型氨基柱柱效低，分离效果差，但基线噪声较小。

针对极性化合物的分离，亲水作用色谱（HILIC）是分离强极性及亲水性化合物的另一色谱模式［21］。此外，通过采用极性或者亲水性的封端试剂对C8或C18表面裸露的硅羟基进行封端，这种改性方式与典型的反相色谱柱相比，增大了内表面的水浸润性，且较低的键合密度也使得孔内疏水性相对减小，因而允许使用100%水相，增强极性化合物的保留［22－23］。基于不同基质色谱柱的选择性不同，试验考察了Ultimate XB－NH2（250mm×4.6mm，5μm）、Shodex Asahipak NH2P－50 40E（250mm× 4.6mm，5μm）、Welch HILIC Amide（150mm× 4.6mm，3μm）和Thermo Hypersil Gold Aq（250mm×4.6mm，5μm）等4种不同填料固定相的色谱柱对极性化合物GDL与CG分离的影响，见图3。

由图3可知：键合型氨基柱XB－NH2和HILIC Amide色谱柱均能满足分离要求，但键合型氨基柱由于柱流失较大，灵敏度较低；HILIC Amide柱分离度较好，但CG裂分为2个色谱峰，且柱流失也较为严重，影响检测的灵敏度［24－25］；Gold Aq色谱柱适合分离强极性化合物，在此固定相上，GDL可以与CG实现基线分离。

对于极性化合物来说，在典型的C8以及C18色谱柱上，即使有机相体积分数为5%也不能够做到有效保留。为实现极性化合物的有效保留，进一步降低有机相含量至零，则会引起色谱柱多孔内表面以及固定键合相的去湿现象（固定相塌陷）。Thermo Hypersil Gold Aq色谱柱对极性化合物有更好的保留性能和更高的分离度，其键合相与分析物之间还存在极性相互作用，因此具有与传统的C18填料不同的选择性，可用于分析一些在反相机制下，在传统的C18固定相上无保留的极性化合物。综合考虑，试验选择Thermo Hypersil Gold Aq色谱柱测定CG中GDL的含量。

2.3 流量对分离度的影响

采用Thermo Hypersil Gold Aq色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈（9＋1）混合溶液，试验考察了流量分别为0.5，1.0mL· min－1时对GDL和CG分离度的影响，见图4。

由图4可知：流量为0.5mL·min－1时GDL和CG的峰较宽。在流量分别为1.0，0.5mL·min－1时，GDL和CG的分离度分别为2.68，2.21。根据VanDeernter方程式：

式中：H为塔板高度；A，B及C为3个常数，其单位分别为cm，cm·s－1，s；u为载气的线速率，cm·。

在高流量时（u＞u），线速率u越大，Cu越大，B／u越小，这时Cu项起主导作用，u增加，H增加，柱效降低［26］。VanDeernter认为线速率在0.1cm·s－1左右时，H最小，柱效最高。根据公式u＝20F／3πD2，对于粒径大于3μm的色谱柱，在线速率为0.1cm·s－1时，内径D为4.6mm的色谱柱，对应的流动相的最佳流量F为1.0mL· min－1。在流量为1.0mL·min－1时，GDL和CG的分离度好，但GDL的出峰较早，容易受溶剂及其他强极性物质的干扰；在流量为0.5mL·min－1时，GDL和CG的分离度稍低，但仍能满足分离要求，综合考虑分离度和保留时间，试验选择流量为0.5mL·min－1。

图3 GDL与CG在不同色谱柱上的色谱图Fig.3 Chromatograms of GDL and CG on different columns

图4 不同流量对GDL和CG分离度的影响Fig.4 Effect of different flow rates on resolution between GDL and CG

2.4 标准曲线和检出限

将150mg·L－1的GDL对照品储备溶液用甲醇逐级稀释配制成质量浓度分别为1.05，7.50，12.0，15.0，22.5mg·L－1的标准溶液系列，以GDL的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：GDL的质量浓度在1.05～22.5mg·L－1内呈线性，线性回归方程为A＝10.462ρ＋10.25，相关系数为0.999 5。

以3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N）为0.32ng，相当于0.000 3%（质量分数，下同）的供试品质量；以10倍信噪比计算测定下限（10S／N）为1.05ng，相当于0.001%的供试品质量。

2.5 精密度与回收试验

称取阴性样品100.0mg共9份，分别加入GDL 1.05，148.35，298.76μg各3份，用甲醇溶解并稀释配制成低、中、高3个浓度水平的溶液，进行加标回收试验，结果见表1。

称取CG试样100.0mg共6份，分别加入GDL对照品储备溶液1.00mL，用甲醇溶解并稀释至10mL，摇匀，即得供试品加标溶液。外标法定量，计算测定值的相对标准偏差（RSD，n＝6）为2.2%；以不同分析人员、不同仪器重复测定，计算RSD为4.7%。结果表明方法的精密度较好。

2.6 稳定性试验

将对照品溶液和供试品加标溶液于室温下放置0，1，2，4，6，8，12h后分别进样，考查方法的稳定性，结果见表2。

表1 回收试验结果Tab.1 Results of test for recovery

表2 稳定性试验结果（n＝7）Tab.2 Results of test for stability

由表2可知：溶液在12h内稳定性较好。

2.7 样品分析

按试验方法对大批量生产的3批CG样品中的GDL含量进行测定，结果表明，3批样品中均未检出GDL残留。

本工作采用带CAD检测器的高效液相色谱法快速测定GDL含量。方法具备操作简单、灵敏度高、选择性好的特点，样品无需衍生化即可直接测定CG中GDL的含量。

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HPLC Determination of Glucono－δ－Lactone in Canagliflozin

D
ONG Shu－bo1，YANG Han－yue2，YAN Zheng－yu1＊
（1.Teaching and Research Section of Analytical Chemistry，College of Science，China Pharmaceutical University，Nanjing210000，China；2.Jiangsu Deyuan Pharm.Co.，Ltd.，Lianyungang222000，China）

A method for determination of Glucono－δ－Lactone（GDL）in Canagliflozin was proposed by HPLC coupled with charged aerosol detection（HPLC－CAD）.The optimized chromatographic conditions were as follows：①Thermo Hypersil Gold Aq column（250mm×4.6mm，5μm）was used as stationary phase；②the mobile phase was a mixture of acetonitrile－water（9＋1）solution with a flow rate of 0.5mL·min－1；③column temperature was 30℃；④the injection volume was 10μL；⑤the nebulization temperature of CAD was set at 50℃，and pressure of carrier gas was 427.5kPa.Under above chromatographic conditions，linearity range for GDL in mass concentration found was 1.05－22.5mg·L－1，and the detection limit（3S／N）found was 0.32ng.Test for recovery was made by standard addition method at 3concentration levels，giving results in the range of 96.2%－103%.The sample solution and reference solution were stable for 12hat room temperature，and RSDs（n＝7）found were 1.8%and 1.3%，respectively.

HPLC；Charged aerosol detection；Glucono－δ－Lactone；Canagliflozin

O652.63

A

1001－4020（2017）04－0387－06

10.11973／lhjy－hx201704004

2016－05－16

董淑波（1984－），男，江苏连云港人，博士研究生，主要从事药物分析研究工作。

＊通信联系人。E－mail：yanzhengyujiang＠sina.com