以金纳米粒子为共振光散射探针测定桑色素和杨梅苷含量

周慧凤，吴 鋆，王 瑜，毕淑云

（长春师范大学化学学院，长春130032）

以金纳米粒子为共振光散射探针测定桑色素和杨梅苷含量

周慧凤，吴 鋆，王 瑜，毕淑云＊

（长春师范大学化学学院，长春130032）

利用种子生长法合成金纳米粒子（AuNPs），提出了以AuNPs为共振光散射（RLS）探针测定桑色素和杨梅苷含量的方法。通过静电引力，AuNPs可与桑色素或者杨梅苷结合，形成二元复合物，使RLS强度增强。桑色素／杨梅苷－AuNPs体系的RLS强度增加值ΔIRLS与桑色素／杨梅苷的浓度呈线性关系，线性范围分别为0.40～10.0，0.10～10.0μmol·L－1，检出限（3S／N）分别为2.98，1.39μg·L－1。应用该方法测定了合成样品中的桑色素和杨梅苷的含量，加标回收率在97.2%～103%之间，测定值的相对标准偏差（n＝5）在0.7%～2.5%之间。

共振光散射；金纳米粒子；桑色素；杨梅苷

桑色素是在黄桑木和桑橙树等中草药中提取的一种异黄酮类化合物，为黄色针状结晶［1］，具有抗肿瘤［2］、抗氧化［3］和抗凝血［4］的药理活性。桑色素作为桑叶的有效成分，对于治疗糖尿病及其并发症具有显著疗效。杨梅苷是一种天然多羟基黄酮类化合物，主要存在于杨梅科植物杨梅的树皮及叶子中，其生物活性很高，具有消炎、抗菌和镇痛等作用［5］。目前关于测定桑色素的方法主要有高效液相色谱法［6］、高效液相色谱法－化学发光法［7］、碳糊电极阳极溶出法［8］和双安培法［9］等，关于测定杨梅苷的方法主要包括高效液相色谱法［10－11］和以CPB为探针的共振光散射光谱法［12］等，但以金纳米粒子（AuNPs）为共振光散射探针测定桑色素和杨梅苷的报道较少。

共振光散射技术兴起于20世纪90年代，由于其具有方便快捷、灵敏度高、准确度高等优点，被国内外分析测试科研人员广泛应用［13－16］。本工作利用种子生长法合成金纳米粒子，并用透射电镜表征其形貌及尺寸，采用共振光散射光谱法和紫外－可见吸收光谱法研究桑色素／杨梅苷与AuNPs相互作用，优化试验条件，并将此方法应用于合成样品的测定中。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

RF－5301PC型双波长荧光分光光度计；TU－1901型双光束紫外－可见分光光度计；pH－3S型精密酸度计。

三羟甲基氨基甲烷－盐酸（Tris－HCl）溶液：三羟甲基氨基甲烷（Tris）与1mol·L－1盐酸、0.1mol· L－1氯化钠配制成pH 8的0.05mol·L－1缓冲溶液。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液：0.1mol·L－1。

四氯金酸（HAuCl4）溶液：0.01mol·L－1。硼氢化钠（NaBH4）溶液：0.01mol·L－1。

硝酸钾、硝酸镁、氯化钠、氯化钙、硫酸铜、硫酸锌和葡萄糖均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 金纳米粒子（AuNPs）的合成

种子液：将0.1mol·L－1CTAB溶液7.5mL加入0.01mol·L－1HAuCl4溶液0.25mL中，随后立即加入0.01mol·L－1的NaBH4溶液（用冰水溶解）0.6mL，快速搅拌2min使溶液混合均匀，此时溶液为棕黄色（金种子），室温下静置1h，备用［］。

生长液：移取0.1mol·L－1CTAB溶液6.4mL，加入0.01mol·L－1HAuCl4溶液0.8mL，混匀后，再向该混合液中滴加0.01mol· L－1抗坏血酸溶液4.8mL，最后加入32mL水稀释。

将种子液用水稀释10倍后，移取60μL加入至生长液中，混合均匀后，在27℃下静置过夜，即得到AuNPs。次日，将AuNPs溶液以10 000r·min－1转速离心2次，除去AuNPs溶液中的表面活性剂。

1.2.2 透射电镜（TEM）表征

移取2.88×10－7mol·L－1的AuNPs溶液1.25mL 2份，分别与2.0×10－4mol·L－1桑色素溶液1.25mL和1.0×10－3mol·L－1杨梅苷溶液1.25mL混匀，进而对AuNPs溶液、桑色素－AuNPs溶液体系和杨梅苷－AuNPs溶液体系进行TEM表征。

1.2.3 共振光散射试验

对于桑色素－AuNPs体系，分别移取1.0× 10－4mol·L－1桑色素溶液25μL和3.6× 10－8mol·L－1AuNPs溶液50μL，并用pH 8的Tris－HCl缓冲溶液定容至2.5mL。

对于杨梅苷－AuNPs体系，分别移取5.0× 10－4mol·L－1杨梅苷和3.6×10－8mol·L－1AuNPs溶液100μL，并用pH 8的Tris－HCl缓冲溶液定容至2.5mL。

在220～800nm范围内，分别扫描桑色素、杨梅苷、AuNPs、桑色素－AuNPs和杨梅苷－AuNPs的共振光散射光谱，激发和发射的狭缝宽度均为3nm。单独AuNPs的共振光散射强度记为I0；桑色素／杨梅苷－AuNPs的共振光散射强度记为Ii；ΔIRLS为Ii与I0之差。

1.2.4 紫外－可见吸收光谱试验

对于桑色素－AuNPs体系，分别移取1.0× 10－4mol·L－1桑色素溶液500μL和3.6× 10－8mol·L－1AuNPs溶液1 000μL，并用pH 8的Tris－HCl缓冲溶液定容至2.5mL。

对于杨梅苷－AuNPs体系，分别移取5.0× 10－4mol·L－1杨梅苷溶液100μL和3.6× 10－8mol·L－1AuNPs溶液500μL，并用pH 8的Tris－HCl缓冲溶液定容至2.5mL。

在220～800nm范围内，分别扫描桑色素、杨梅苷、桑色素－AuNPs和杨梅苷－AuNPs的紫外－可见吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 TEM表征

AuNPs、桑色素－AuNPs和杨梅苷－AuNPs的TEML图见图1。

由图1可知：合成的AuNPs长度为41.5nm，直径为28.1nm；桑色素－AuNPs的长度为59.1nm，直径为46.9nm；杨梅苷－AuNPs的长度为56.2nm，直径为50.0nm。桑色素－AuNPs和杨梅苷－AuNPs不仅尺寸变大，而且分布整齐均匀。

图1 AuNPs（a）、桑色素－AuNPs（b）和杨梅苷－AuNPs（c）的TEM图Fig.1 TEM images of AuNPs（a），morin hydrate－AuNPs（b）and myricetin－AuNPs（c）

2.2 共振光散射光谱

桑色素、杨梅苷、AuNPs、桑色素－AuNPs及杨梅苷－AuNPs的共振光散射光谱见图2。

图2 桑色素－AuNPs（a）和杨梅苷－AuNPs（b）体系的共振光散射光谱Fig.2 RLS spectra of（a）morin hydrate－AuNPs systum and（b）myricetin－AuNPs systum

由图2可知：桑色素、杨梅苷和AuNPs的RLS强度较弱，当AuNPs加入到桑色素或杨梅苷溶液中，体系的RLS强度明显提高。桑色素和杨梅苷均为黄酮类物质，它们的pKa分别为5.09［18］和5.23［19］。当pH为8时，桑色素和杨梅苷均发生解离，以负电荷的形式存在于体系中，由于AuNPs表面被阳离子表面活性剂CTAB包裹而带有正电荷，桑色素或杨梅苷与AuNPs产生静电引力而结合在一起，形成二元复合物，从而引起RLS强度的明显改变。桑色素－AuNPs、杨梅苷－AuNPs体系的RLS最高强度峰分别出现在294，291nm，因此试验选择桑色素－AuNPs、杨梅苷－AuNPs体系的共振光散射光谱的检测波长分别为294，291nm。

2.3 紫外－可见吸收光谱

桑色素－AuNPs、杨梅苷－AuNPs体系的紫外－可见吸收光谱见图3。

由图3可知：桑色素－AuNPs体系有4个吸收峰，分别在波长220，276，327，392nm处，相比于单独的桑色素的吸收峰均发生了红移。如果最大吸收峰的波长向长波长方向移动，那么就表明物质的粒径增大［20］。AuNPs由于表面被CTAB包裹而带有正电荷，与桑色素的阴离子通过静电引力形成复合物，粒径变大，最终影响吸收峰产生了红移。同理，杨梅苷在377nm处的吸收峰红移至379nm处，因此，AuNPs与杨梅苷也通过静电引力发生相互作用而形成杨梅苷－AuNPs二元复合物。

2.4 试验条件的选择

2.4.1 体系酸度

试验采用Tris－HCl缓冲溶液来控制体系的酸度，考察了酸度对体系RLS强度的影响，见图4。

由图4可知：在桑色素／杨梅苷－AuNPs体系中，当pH小于8时，随着pH增大，体系的ΔIRLS也随之增大；当pH为8时，ΔIRLS出现最大值；当pH大于8时，体系的ΔIRLS随pH增大而减小。试验选择桑色素／杨梅苷－AuNPs体系的酸度为pH 8。

图3 桑色素－AuNPs（a）和杨梅苷－AuNPs（b）体系的紫外吸收光谱Fig.3 UV－Vis absorption spectra of morin hydrate－AuNPs systum（a）and myricetin－AuNPs systum（b）

图4 酸度对桑色素－AuNPs体系和杨梅苷－AuNPs体系的共振光散射强度的影响Fig.4 Effect of acidity on RLS intensity of morin hydrate－AuNPs systum and myricetin－AuNPs systum

2.4.2 反应时间及加样顺序

在20～45℃温度下，试验考察了桑色素／杨梅苷与AuNPs的加样顺序和反应时间对体系ΔIRLS的影响。结果表明两种因素对体系的ΔIRLS均没有产生明显的影响。

2.4.3 AuNPs的浓度

AuNPs的浓度对桑色素／杨梅苷－AuNPs体系的影响见图5。

图5 AuNPs浓度对桑色素－AuNPs体系和杨梅苷－AuNPs体系的共振光散射强度的影响Fig.5 Effect of concentration of AuNPs on RLS intensity of morin hydrate－AuNPs systum and myricetin－AuNPs systum

由图5可知：对于桑色素－AuNPs体系来说，当AuNPs的浓度低于7.2×10－10mol·L－1时，体系的ΔIRLS随着AuNPs浓度的增加而增大，当AuNPs的浓度高于7.2×10－10mol·L－1时，体系的ΔIRLS随着AuNPs浓度的增加而减小。因此，在桑色素－AuNPs体系中，试验选择AuNPs的浓度为7.2× 10－10mol·L－1。同理，对于杨梅苷－AuNPs体系，试验选择AuNPs的浓度为1.44×10－9mol·L－1。

2.5 离子强度的影响

离子强度对桑色素／杨梅苷－AuNPs体系的影响见图6。

由图6可知：随着氯化钠质量浓度的增加，桑色素／杨梅苷－AuNPs体系的ΔIRLS明显降低，可能是因为桑色素／杨梅苷解离出的阴离子与Na＋产生静电引力，从而削弱了桑色素／杨梅苷与AuNPs的结合作用。

2.6 共存物质的影响

试验考察了一些金属离子和葡萄糖对桑色素／杨梅苷－AuNPs体系的影响。结果显示：当相对误差控制在±5%以内时，在桑色素－AuNPs体系中，4 000倍的K＋，2 000倍的Na＋，1 000倍的Mg2＋，100倍的Zn2＋，8倍的Ca2＋、Cu2＋，10倍的葡萄糖不干扰测定；在杨梅苷－AuNPs体系中，800倍的K＋，200倍的Na＋，400倍的Mg2＋，8倍的Zn2＋，10倍的Ca2＋、Cu2＋、葡萄糖不干扰测定。表明K＋、Na＋和Mg＋对两个体系的影响均很小，桑色素－AuNPs体系对Ca2＋、Cu2＋和葡萄糖的耐受量较小，杨梅苷－AuNPs体系对Zn2＋、Ca2＋、Cu2＋和葡萄糖的耐受量较小，但Zn2＋、Ca2＋、Cu2＋和葡萄糖对两个体系测定都不产生干扰。因此，方法具有较好的选择性。

图6 离子强度对桑色素－AuNPs（a）和杨梅苷－AuNPs（b）体系的共振光散射强度的影响Fig.6 Effect of ion strength on the RLS intensity of morin hydrate－AuNPs systum（a）and myricetin－AuNPs systum（b）

2.7 标准曲线和检出限

在最佳的酸度和AuNPs浓度下，依次加入不同浓度的桑色素／杨梅苷进行共振光谱扫描，以桑色素／杨梅苷的浓度为横坐标，体系的ΔIRLS为纵坐标绘制标准曲线，所得线性回归方程及相关系数见表1。

以3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N），结果见表1。

表1 线性参数与检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.8 合成样品分析

试验根据桑色素／杨梅苷－AuNPs体系，利用共振光散射光谱法测定了合成样品中桑色素／杨梅苷的含量，结果见表2。

表2 合成样品中桑色素和杨梅苷的分析结果（n＝5）Tab.2 Analytical results of morin hydrate and myricetin in synthetic sample

由表2可知：加标回收率在97.2%～103%之间，相对标准偏差（RSD）在0.7%～2.5%之间。

本工作利用AuNPs作为RLS探针，研究了桑色素／杨梅苷与AuNPs之间的相互作用，对桑色素／杨梅苷含量进行测定。桑色素／杨梅苷与AuNPs以静电作用相结合，使RLS强度显著增强，并对AuNPs及桑色素／杨梅苷－AuNPs进行了TEM表征，佐证了光谱法的结果。该方法应用于合成样品中测定桑色素／杨梅苷的含量，结果满意。

参考文献：

［1］ HU Y J，YUE H L，LI X L，et al.Molecular spectroscopic studies on the interaction of morin with bovine serum albumin［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2012，112：16－22.

［2］ 宋玉民，康敬万，卢小泉，等.桑色素及其配合物与DNA作用的研究［J］.高等学校化学学报，2003，24（2）：249－251.

［3］ PATHAK S M，UDUPA N.Pre－clinical evidence of enhanced oral bioavailability of the P－glycoprotein substrate talinolol in combination with morin［J］.Biopharmaceutics ＆Drug Disposition，2010，31（2／3）：202－214.

［4］ 赵文华，高军林.荧光光谱法研究桑色素与人血清白蛋

白的相互作用［J］.福建分析测试，2013，22（6）：10－13.［5］ 陈健，郭瑞雪，谢彦瑰.杨梅苷脂质体在动物体内药代

吸收动力学初步研究［J］.中国食品添加剂，2010（5）：78－82.

［6］ 喻樊.HPLC法同时测定濒危植物—中华补血草中异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量［J］.药物分析杂志，2014，34（4）：632－635.

［7］ 刘焱，高智席，黄成.HPLC－CL法测定桑叶中芦丁和桑色素［J］.安徽农业科学，2008，36（21）：9128－9129.

［8］ 廖声华，田秋霖，吴卫兵.碳糊电极阳极溶出法测定中药甘草中桑色素［J］.理化检验－化学分册，2004，40（3）：140－142.

［9］ 张君才.桑枝中桑色素的双安培法在线测定［J］.分析测试学报，2006，25（1）：112－114.

［10］ 齐洁，万竹青，李默影，等.HPLC法测定杨梅叶中杨梅苷的含量［J］.中国野生植物资源，2012，31（1）：35－37.

［11］ 孟丽娟，程松，潘英妮，等.HPLC法同时测定侧柏叶

中杨梅苷等4种黄酮的含量［J］.沈阳药科大学学报，2014，31（2）：107－111.

［12］ 王天娇，毕淑云，赵婷婷，等.CPB与杨梅苷相互作用的共振光散射研究及其应用［J］.分子科学学报，2014，30（1）：18－21.

［13］ 陈展光，丁卫锋，韩雅莉，等.两性离子表面活性剂作为共振光散射探针测定脱氧核糖核酸［J］.分析化学，2005，33（4）：519－522.

［14］ 李原芳，申晓韦，黄承志，等.共振光散射法测定复方氨基酸注射液中色氨酸的含量［J］.分析化学，2008，36（6）：819－822.

［15］ 王雪，吴立航，陈艳华，等.氯金酸共振光散射探针测定阳离子表面活性剂［J］.分析化学，2011，39（12）：1882－1886.

［16］ BI S Y，WANG Y，ZHOU H F，et al.Assembly of AuNRs and eugenol for trace analysis of eugenol using resonance light scattering technique［J］.Materials Science and Engineering：C，2016，58：1001－1007.

［17］ 陶俊.金属纳米颗粒及其聚合物复合薄膜的光学特性研究［D］.合肥：中国科学技术大学，2011.

［18］ ROY A S，DINDA A K，CHAUDHURY S，et al.Binding of antioxidant flavonol morin to the native state of bovine serum albumin：effects of urea and metal ions on the binding［J］.Journal of Luminescence，2014，145：741－751.

［19］ BI S Y，WANG T J，ZHAO T T，et al.The resonance Rayleigh light scattering spectral investigation on the interaction of DNA with camellia sinensis in the presence of CPC and its analytical application［J］.Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2014，127：335－339.

［20］ JIANG Z L，FENG Z W，LI T S，et al.Resonance scattering spectroscopy of gold nanoparticle［J］.Science China Chemistry，2001，44（2）：175－181.

RLS Determination of Morin Hydrate and Myricetin Using Gold Nanoparticles as Probe

ZHOU Hui－feng，WU Jun，WANG Yu，BI Shu－yun＊
（College of Chemistry，Changchun Normal University，Changchun130032，China）

Gold nanoparticles（AuNPs）were synthesized by seed growth method，and resonance light scattering（RLS）was proposed for determination of morin hydrate and myricetin using AuNPs as probe.Morin hydrate or myricetin was bond to AuNPs by electrostatic interaction，which leaded to an obviously enhancement of RLS intensity.Linear relationships betweenΔIRLSand concentration were obtained in the range of 0.40－10.0μmol·L－1for morin hydrate and 0.10－10.0μmol·L－1for myricetin，with detection limits（3S／N）of 2.98，1.39μg·L－1，respectively

.The proposed method was used in the determination of morin hydrate and myricetin in synthesized samples.Test for recovery was made by standard addition method，giving values of recovery in the range of 97.2%－103%，with RSDs（n＝5）ranged from 0.7%to 2.5%.

Resonance light scattering；Gold nanoparticles；Morin hydrate；Myricetin

O657.3

A

1001－4020（2017）04－0381－06

10.11973／lhjy－hx201704003

2016－06－02

吉林省教育厅“十二五”科技发展计划项目（20140257）；长春师范大学研究

生教育创新基金项目（cscxy2015002）

周慧凤（1992－），女，内蒙古呼伦贝尔人，硕士研究生，研究方向为光谱分析化学。

＊通信联系人。E－mail：sy＿bi＠sina.com