优质桔红心大白菜种质创新与新品种选育

张一卉 李化银+王凤德 李景娟 丁谦 刘立锋+孙令强 徐少君+孔涛+王翠花 何启伟 高建伟 ��

摘要：本試验利用分子育种手段开展了优质桔红心大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）种质创新与新品种选育研究。我们克隆了控制大白菜桔红心的关键基因BrCRTISO，分析了桔红心、白心大白菜之间BrCRTISO基因的结构差异。根据启动子和编码区序列的差异，筛选出了与桔红心紧密连锁的SNP和InDel分子标记。在传统有性杂交的基础上，利用上述SNP和InDel标记对后代分离群体进行辅助选择，筛选出了早熟、优质、抗病的桔红心优异纯系种质08428、08460、08468、08469自交不亲和系。利用上述4个纯系配置组合，选育出了早熟优质抗病的特色大白菜新品种“天正桔红65”、“天正桔红62”。连续多年（2010—2016）种植试验及抗病性鉴定的结果表明：这两个新品种抗病性强，适宜春秋种植，早熟（55～60天）；叶球中小型，桔红色。其中“天正桔红65”β-胡萝卜素含量高达26.163 mg/gDW，是普通大白菜的11.15倍；可溶性固形物含量高，口感品质极佳。2014年，“天正桔红62”成为泰安市岱岳区地理标志性产品（商标注册号：13066669）。2015—2016年，两个品种通过了国家、省（市）农作物品种审定委员会的审定（鉴定）。本研究是利用分子育种手段快速培育优良大白菜新品种的成功范例，可为其它生物分子育种工作提供参考。

关键词：大白菜；桔红心；分子标记；种质创新；新品种选育

中图分类号：S634.103.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）05-0014-10

Germplasm Innovation and New Variety Breeding in Orange

Leafy Head Chinese Cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）

Zhang Yihui1， Li Huayin1*， Wang Fengde1， Li Jingjuan1， Ding Qian1， Liu Lifeng1，

Sun Lingqiang2， Xu Shaojun3， Kong Tao4， Wang Cuihua1， He Qiwei1， Gao Jianwei1

（1. Institute of Vegetables and Flowers， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；

2.Qingdao Seed Management Station， Qingdao 266071， China； 3. Qingdao Hefeng Seeds Co.， Ltd.，

Jiaozhou 266300， China；4. Daiyue District Agricultural Bureau， Taian 271021， China）

AbstractIn this research， the molecular breeding was used to innovate germplasm and select new varieties in orange leafy head Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）. We cloned the candidate key gene BrCRTISO， which coded carotenoid isomerase controlling synthesis of orange pigments in leafy head. Differences in structure of BrCRTISO gene between orange and white leafy head Chinese cabbage were also analyzed， in which， one SNP（C952-T952）marker and one InDel marker Bror-intron1 closely linked with orange leafy head were developed. New good pure self-incompatible lines of orange leafy head germplasm had been innovated by molecular marker assisted selection， of which， 08428， 08460， 08468 and 08469 were better than others. These four lines were applied to make cross combinations， from which， new orange leafy head varieties Tianzhengjuhong 65 and Tianzhengjuhong 62 were obtained. Planting and disease resistance tests for several years （2010-2016） showed that these two new varieties had strong disease resistance， and their growth periods were short （55～60 days）， which were suitable for being cultivated in spring or autumn. The β-carotene content of Tianzhengjuhong 65 reached 26.163 mg/gDW， 11.15 times of common Chinese cabbage. In addition， the content of soluble solids was also higher than other Chinese cabbage varieties， which owned good taste. In 2014， Tianzhengjuhong 62 was approved to be Chinese National Protected Geographic Indication Product （No. 13066669 ） in Taian， China. In 2015， Tianzhengjuhong 65 was approved by both National and Beijing Crop Variety Approval Committee. Meanwhile， Tianzhengjuhong 62 was approved by Beijing Crop Variety Approval Committee. In 2016， Tianzhengjuhong 65 was approved by Shandong Crop Variety Approval Committee. This paper would be useful to other plant molecular breeding because of our successful breeding work.

KeywordsChinese cabbage； Orange leafy head； Molecular markers； Germplasm innovation； New variety breeding

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）起源于中国，是我国的特产蔬菜。韩国、日本等东亚国家种植的大白菜最早由我国传入。长期以来，大白菜一直是我国和东亚国家的骨干蔬菜，其重要地位和生产面积是其它蔬菜难以相比的。在我国北方，大白菜是秋季栽培和冬春供应的主要蔬菜，种植面积大、范围广[1]。山东省作为大白菜的主要起源地之一，栽培历史悠久，种质资源极为丰富，其中有誉满海内外的胶东大白菜，有特点鲜明的德州香把子，有深受济南本地人喜爱的唐王大白菜等[2]。随着我国农业产业结构的调整和保护地栽培蔬菜的发展，大白菜一季生产半年供应的格局已发生了显著变化。随着人们生活水平的不断提高，人们将更多地关注大白菜的质量，即形状、大小、色泽、营养、风味口感及无公害等指标。

桔红心大白菜因其色泽艳丽、富含胡萝卜素等多种维生素、营养价值高、口感好而倍受消费者青睐。日本桔红心大白菜育种起步较早，培育了许多优良品种。但是在我国，日本的桔红心大白菜品种种子昂贵，不抗病毒病，病重地区和年份常常绝产，难以获得丰产和稳产。因此，培育适宜山东等地种植的高抗病毒病、霜霉病、软腐病的桔红心大白菜新品种，实现其种子国产化显得尤为重要[3]。

针对上述问题，本课题组自2002年起开始收集、鉴定桔红心大白菜资源材料，研究桔红心性状遗传特性。2007—2010年间，我们通过拓宽育种资源，利用杂交组合选配测配，结合分子标记辅助选择技术，选育出适合春秋两季种植的桔红心大白菜新品种“天正桔红65”、“天正桔红62”。2014年，“天正桔红62”成为泰安市岱岳区地理标志性产品（商标注册号：13066669）。2015年，两品种通过了国家、北京市农作物品种审定委员会的审定（鉴定）；2016年，“天正桔红65”又通过了山东省农作物品种审定委员会的审定。

1材料与方法

1.1试验材料

桔红心大白菜一代杂交种：北京桔红心、红抗1号、长研橘宝、申萌桔红心、神狮桔红心。桔红心大白菜纯系：桔08410、14-490、1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669。白心（或者黄心）大白菜一代杂交种：寒秀、金典春王、凯春、日本夏阳。白心（或者黄心）大白菜纯系：新福08410、14-401、663、1466、1469、1505、1510、1720、叠锥抗2。杂交组合（14-401×14-490）及其F2代分离群体。

1.2基因克隆及生物信息学分析

1.2.1基因组DNA提取取大白菜叶片，液氮冷冻后快速研磨，采用快捷型植物基因组DNA提取系统（天根生化科技有限公司）提取基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测。

1.2.2总RNA提取和反转录取结球后期的球叶提取总RNA。采用TRNzol-A+试剂盒（天根生化科技有限公司）进行RNA提取，方法参考说明书。反转录按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （大连宝生物）产品说明书操作。

1.2.3PCR扩增PCR反应体系（20 μL）为：2×高保真PCR Mix 10 μL，上游引物（10 mmol/L）0.5 μL，下游引物（10 mmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，36个循环；72℃ 10 min。

1.2.4SDS-PAGE电泳检测将PCR产物与上样缓冲液混匀，然后将混合物95℃预变性10 min。取4 μL点样，利用8%变性聚丙烯酰氨凝胶进行电泳检测，在Sequi-Gen GT核酸电泳系统（Bio-Rad，USA）中进行电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，在25℃、55 W恒功率下电泳1 h，通过银染法显影、拍照并记录结果。

1.2.5生物信息学分析将克隆的基因序列在GenBank中进行BLAST检索，查找大白菜目标基因在其它物种中的同源序列。利用DNAMAN 6.0软件对来自不同物种的基因编码的氨基酸序列进行比对并构建系统进化树。

1.3β-胡萝卜素等营养成分的测定

利用高效液相色谱法测定大白菜β-胡萝卜素含量[5-7]。称取5.0 g左右干净的成熟期大白菜内叶，剪碎，置于三角瓶中，用石油醚∶丙酮（体积比为80∶20）混合液振摇提取，移出上清液，重复提取直至提取液无色，合并提取液，转入圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸发至干，用二氯甲烷溶液提取残渣，过滤后用凝胶色谱仪净化。净化后的溶液用于HPLC分析。使用吉尔森高效液相色谱仪，色柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，流动相为甲醇∶乙腈（体积比为90∶10），流速为1.0 mL/min；检测波长为450 μm，进样量20 μL。利用PAD在波长200～800 nm范围内扫描，分析物质的特征吸收峰。

可溶性固形物含量的测定参照标准《NY/T 2637—2014 水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法（2015-1-1实施）》。

1.4分子标记辅助选择及常规杂交育种

分子标记辅助选择育种及常规杂交育种参照钱前等（2012）[4]和柯桂兰（2010）[1]。

2结果与分析

2.1控制大白菜桔红心形成的关键候选基因的选择策略

与普通大白菜相比，桔红心大白菜的叶球内叶呈现桔红色。切开后剖面经阳光照射，球叶的桔红色快速增强。以往研究表明，桔红心大白菜内叶含有类似番茄红素的复合物等多种类胡萝卜素[5-7]。类胡萝卜素在植物体内通过类异戊二烯途径合成，呈现黄色、橙红色和红色。在拟南芥[6]、番茄[7]等模式植物中，人们对类胡萝卜素生物合成途径及其相关酶（或基因）的功能研究得很清楚[6-8]。植物中，许多桔红色性状的出现都与类胡萝卜素异构酶有关。类胡萝卜素异构酶CRTISO 能催化前番茄红素形成全反式番茄红素[9，10]。Park 等（2002）[6]在拟南芥中分离了CRTISO基因，通过分析其功能，发现类胡萝卜素异构酶缺失突变体主要積累前番茄红素和前链孢红素（7， 9， 9′–三顺式–链孢红素）。Isaacson 等（2002）[7]利用图位克隆技术获得了番茄桔红色基因tangerine，该基因编码一个类胡萝卜素异构酶CRTISO，tangerine突变体缺失CRTISO 导致番茄积累前番茄红素和β-胡萝卜素，果实呈现桔红色。因此，在筛选控制大白菜桔红心形成的关键候选基因时，我们首先选择了编码类胡萝卜素异构酶的基因BrCRTISO作为候选基因。