苹果酒专用酿酒酵母Y2菌剂研究

吴荣荣，赵娟娟，程书梅

(1.衡水学院生命科学系，河北衡水053000； 2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000)

苹果酒专用酿酒酵母Y2菌剂研究

吴荣荣1，赵娟娟1，程书梅2

(1.衡水学院生命科学系，河北衡水053000； 2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000)

对实验室保藏苹果酒专用酿酒酵母Y2的发酵条件和保护剂进行优化。结果表明，Y2培养基的最适组成为葡萄糖1.5%，KNO32%，MgSO40.15%；Y2最适培养条件分别为，温度25℃，接种量1.5%，培养时间为14 h，pH4.0，培养液中菌体OD值可达1.30。保护剂的最佳组合分别为脱脂奶粉14%，甘油3%，谷氨酸钠3%，吐温80为0.5%。冷冻干燥后菌剂的活菌数为8.45×1011cfu/g。

酿酒酵母； 培养基； 培养条件； 冷冻保护剂

苹果酒是近年来在我国流行的一种果汁饮料，产量和知名度在国际上略低于葡萄酒，酒精度含量低，是第二大果酒[1]。它既有美酒的芬芳又有果汁的风味，含有多种人体所需氨基酸、丰富的维生素、有机酸等[2]，口感清醇，营养丰富。

酵母菌种的发酵性能是否良好直接影响苹果酒品质的好坏。用发酵能力和繁殖能力较高、抗二氧化硫能力较强的酵母启动发酵，可提高发酵速率，酿造出的苹果酒具有较好的品质。缺少专用苹果酒发酵酵母是制约我国苹果酒发展的一个重要原因[3]。制备高品质的苹果酒酿酒酵母，应保证其具有起酵迅速、降糖能力好、沉降性能好、方便分离、产酒量大、酒香协调等优良特征[4-5]。

本研究拟对实验室保藏的苹果酒专用酿酒酵母Y2的制备技术进行研究，主要从菌株生长培养基最适碳源、氮源、无机盐，以及培养过程中的最适生长温度、最适生长pH值、最适接种量、最适培养时间几个方面进行研究。通过对酿酒酵母的生长情况的测定，以期对工业化生产用的苹果酒专用酵母培养基及培养条件进行优化[6-10]，获得高数量和高活性的酿酒酵母菌剂。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

菌株：实验室保藏的酵母菌Y2。

培养基：YPD基础培养基。

仪器：超净工作台，Swut SE型电子天平，LRH系列生化培养箱，722S可见分光光度计，SK-1型快速混匀器，PHB-4便携式pH计，BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅，移液枪。

1.2 实验方法

1.2.1 苹果酒专用酵母菌培养基的优化

（1）单因素实验

考察不同碳源、氮源、无机盐对酵母菌生长的影响。每500 mL三角瓶装100 mL培养基，121℃灭菌20 min。分别接入3种菌株以28℃、120 r/min振荡培养24 h后，在560 nm处测定吸光度。

（2）正交实验

采用4因素3水平的L9(34)正交实验，以碳源、氮源、无机盐为考察因素，确定培养基的最佳组成，因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平

1.2.2 苹果酒专用酵母培养条件的优化

（1）单因素实验

考察不同的培养温度（10℃、15℃、20℃和25℃），pH值（4.0、4.5、5.0、5.5），接种量（1%、1.5%、2%、2.5%），培养时间（14 h、18 h、22 h、24 h）对酵母生长的影响。

（2）正交实验

采用4因素3水平的L9(34)正交实验，以温度、pH值、培养时间、接种量为考察因素，确定培养基的最佳组成。因素水平见表2。

表2 正交实验因素水平

1.2.3 冷冻保护剂

采用4因素3水平的L9(34)正交实验，以脱脂奶粉、甘油、谷氨酸钠和吐温80为考察因素，确定对酵母菌生物量的影响，因素水平见表3。

表3 正交实验因素水平

2 结果与分析

2.1 苹果酒专用酵母菌培养基的优化

2.1.1 单因素实验结果

（1）碳源对酵母菌生长的影响

将YPD培养基中的葡萄糖分别以等量的蔗糖、淀粉、玉米粉替换，测得560 nm处的OD值见图1。

图1 碳源对酵母菌生长的影响

由图1可以看出，菌株Y2在碳源为葡萄糖的培养基中生长得最好，OD值为0.86，其次为蔗糖、淀粉，在玉米粉中生长得最少。表明苹果酒酿酒酵母在单糖的环境中生长得最好。

（2）氮源对酵母菌生长的影响

将YPD培养基中的蛋白胨分别以尿素、硫酸铵和硝酸钾代替，测得560 nm处的OD值见图2。

由图2可以看出，Y2在氮源为硝酸钾或硫酸铵的培养基中的生长量相当，OD值分别为0.726和0.603，菌株的生长量大。其次为蛋白胨，在尿素中生长量最少。

（3）无机盐对酵母菌生长的影响

将YPD培养基中的MgSO4·7H2O分别用硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌代替，测得560 nm处的OD值见图3。

图2 氮源对酵母菌生长的影响

图3 无机盐对酵母菌生长的影响

由图3可以看出，菌株在无机盐为MgSO4的培养基中生长得最好，OD值为0.973，其次为硫酸亚铁和硫酸锰，在硫酸锌中生长情况最差。

2.1.2 培养基正交实验结果

对培养基的碳源、氮源、无机盐3个因素进行3因素3水平的正交实验，确定苹果酒酿酒酵母培养基的最佳组合。实验结果见表4、表5。

表4 酿酒酵母Y2发酵实验结果

由表4、表5可知，对于Y2，碳源影响最为显著，其次为无机盐，氮源的影响最小。方差分析结果显示，在95%的置信区间内，3个因素的F比都小于F临界值，对OD值的影响不显著。其最佳发酵参数为组合8。因此培养基成分的最佳组合为碳源1.5%、氮源2%、无机盐0.15%。

表5 酿酒酵母Y2正交实验方差分析

2.2 苹果酒专用酵母菌培养条件的优化

2.2.1 单因素实验结果

（1）生长温度对酵母的影响

不同温度10℃、15℃、20℃和25℃下，120 r/min振荡培养16 h，560 nm下测定OD值，实验结果见图4。

图4 生长温度对酿酒酵母Y2菌株的影响

由图4可以看出，酿酒酵母Y2菌株随着培养温度的升高，生长量逐渐增加，在25℃时，生长最好，OD值最大为0.806。

（2）生长pH值对Y2酵母菌株的影响

不同pH值4.0、4.5、5.0和5.5的YPD液体培养基接种量3%，28℃下，120 r/min振荡培养16 h，于560 nm下测定OD值，实验结果见图5。

由图5可以看出，Y2菌株对不同的pH值适应性不同。Y2最适pH值为4.5，OD值为0.953，随着pH值的升高其生长量减少。

（3）接种量对Y2酵母菌的影响

将Y2按1%、1.5%、2%、2.5%接种量接种到YPD液体培养基中，在28℃、120 r/min振荡培养16 h后，于560 nm下测吸光度值，结果见图6。

图5 生长pH值实验结果对酿酒酵母Y2的影响

图6 接种量实验结果对酿酒酵母Y2的影响

由图6可以看出，Y2的最适接种量为1.5%，OD值为0.828，后随着接种量的增加，菌株生长量减少，OD值下降。

（4）培养时间对酵母的影响

按3%接种量接种到YPD液体培养基中，在28℃、120 r/min振荡培养14 h、18 h、22 h和24 h后，于560 nm下测吸光度值，实验结果见图7。

图7 培养时间对酿酒酵母Y2的影响

由图7可以看出，酵母菌Y2的最适培养时间为14 h，OD值为0.918，后随着培养时间的延长，菌株生长量减少，OD值下降。

2.2.2 培养条件的正交实验结果

对培养条件温度、接种量、培养时间和pH值4个因素进行4因素3水平的正交实验，确定苹果酒酿酒酵母培养条件的最佳组合。酿酒酵母Y2发酵实验结果见表6、表7。

表6 酿酒酵母Y2发酵实验结果

表7 酿酒酵母Y2正交实验方差分析

由表6、表7可看出，培养温度影响最大，其次为培养时间和pH值，接种量的影响最小。在95%的置信区间内，4个因素对OD值的影响都不显著。最佳发酵参数为组合5，其OD值达到1.30。按理论最优条件进行验证实验，结果OD值小于5号组合，因此培养条件的最佳组合为5号，温度25℃、接种量1.5%、培养时间14 h、pH4.0。

2.3 冷冻保护剂的研究

以脱脂奶粉、甘油、谷氨酸钠和吐温80为考察因素，采用4因素3水平的L9(34)正交实验，确定对酵母菌Y2菌株生物量的影响，实验结果见表8、表9。

由表8、表9可看出，谷氨酸钠对活菌数影响最大，其次是脱脂奶粉和甘油，吐温80的影响最小。方差分析结果显示，在95%的置信区间内，脱脂奶粉和谷氨酸钠对OD值的影响显著。最佳参数为组合5，其活菌数为84.5×1010cfu/g。按理论最优条件进行验证实验，结果显示活菌数低于组合5，因此保护剂的最佳组合为5号组合，脱脂奶粉14%、甘油3%、谷氨酸钠3%和吐温80为0.5%。

表8 酿酒酵母Y2保护剂实验结果

表9 酿酒酵母Y2正交实验方差分析

3 结论

通过单因素及正交实验，根据测定酿酒酵母Y2在发酵过程中560 nm处的OD值，确定了Y2在发酵过程中最适宜的碳源、氮源、无机盐分别为葡萄糖、KNO3和MgSO4，培养基成分的最佳组合为碳源1.5%、氮源2%、无机盐0.15%；最适培养条件为温度25℃、接种量1.5%、培养时间14 h、pH4.0；保护剂的最佳组合为脱脂奶粉14%、甘油3%、谷氨酸钠3%和吐温80为0.5%。最终获得了适宜苹果酒酿造的高数量和高活性的酵母菌，冷冻干燥后菌剂的活菌数为8.45×1011cfu/g。

[1] 阮仕立,李华.苹果酒-极具潜力的酒中新贵[J].中国酒, 2000(4)：54-55.

[2] 潘文强.开发生产苹果酒前景广阔[J].山西食品工业, 1997(3)：33-42.

[3]赵志华,岳田利,王燕妮,等.酿酒活性干酵母(AADY)的研究[J].中国酿造,2006(11)：1-4.

[4] 彭帮柱.增香型苹果酒酵母的选育研究[D].西安：西北农林科技大学,2004：14-23.

[5] 赵硕,李平,王卿.耐高糖酵母菌株的选育及应用[J].安徽农业科学,2010,38(9)：4801-4803.

[6] 张晓敏,李擎,王耀,等.苹果酒酿造工艺及成分研究进展[J].农产品加工,2015(14)：68-70.

[7] 王玉莹,戴洪义.响应面法优化苹果酒发酵工艺[J].中国酿造,2012,31(8)：19-23.

[8] 贺金梅.中心组合设计优化热带假丝酵母菌冷冻干燥保护剂[J].食品科学,2013,34(1)：244-247.

[9] 张大为,张洁,高健,等.柑橘酒酿造酵母的筛选及鉴定[J].酿酒科技,2016(7)：42-46.

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Y2：an S.cerevisiae Strain Exclusively Used for Cider Production

WU Rongrong1，ZHAO Juanjuan1and CHENG Shumei2
(1.College of Life Science,Hengshui University,Hengshui,Hebei 053000;2.College of Food Science and Technology,HebeiAgricultural University,Baoding,Hebei 071000,China)

In this study,the fermenting conditions and the cryoprotectant formulation of S.cerevisiae strain Y2 exclusively used for cider were explored.The results showed that,its best culture medium was composed of 1.5%glucose,2%KNO3and 0.15%MgSO4; its best culture conditions included temperature at 25℃,1.5%inoculation quantity,14 h fermenting time,and pH value 4.0(OD value of the broth reached up to 1.30);its best cryoprotectant formulation was 14%skim milk powder,3%glycerin,3%monosodium glutamate and 0.5%Tween 80,respectively(the viable count of S.cerevisiae strain reached up to 8.45×1011cfu/g).

S.cerevisiae;culture medium;culture conditions;cryoprotectant

TS262.4；TS261.4

A

1001-9286（2017）05-0047-05

10.13746/j.njkj.2016307

项目名称“苹果酒专用酿酒酵母Y2菌剂研究”，河北省科技支撑项目(13213002)。

2016-10-14

吴荣荣（1976-），女，河北衡水人，博士，研究方向：食品科学，E-mail：rpkxw@126.com。