人外周血γδT细胞免疫治疗裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤的体内实验研究①

夏 莉 迟艳飞 李晓峰 王 娟 刘柏林 韩桂红 刘龑航 刘玉侠

(吉林省人民医院，长春130021)

人外周血γδT细胞免疫治疗裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤的体内实验研究①

夏 莉 迟艳飞 李晓峰 王 娟 刘柏林 韩桂红 刘龑航 刘玉侠②

(吉林省人民医院，长春130021)

目的：研究不同剂量的人外周血γδT细胞对裸鼠人肝癌细胞(SMMC-7721)移植瘤模型的免疫治疗作用。方法：①用人肝癌细胞株SMMC-7721接种BALB/c裸鼠皮下,建立肝癌裸鼠模型。②从健康人外周血中提取单核细胞，体外特异性扩增γδT细胞。③将已建立的肝癌裸鼠模型随机分为5组,阳性对照组为5-氟尿嘧啶(5-Fu)，阴性对照组为生理盐水，治疗组用不同剂量的γδT细胞(1×105、5×105及25×105)分别注入裸鼠尾静脉，阳性对照组用5-Fu裸鼠腹腔注射，阴性对照组用生理盐水裸鼠尾静脉注射。观察不同剂量的γδT细胞对肿瘤的抑制效果，包括治疗前后的体重、食物摄取量及生长状况等，并与阳性对照组和阴性对照组比较肿瘤体积(TV)、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增殖率[T/C(%)]变化。结果：不同剂量的γδT细胞对裸鼠移植瘤的生长有不同程度的抑制，RTV与生理盐水阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与5-Fu阳性对照组比较，TV增长明显低于5-Fu阳性对照组，RTV各剂量组抑制程度相似，均略高于5-Fu阳性对照组，T/C(%)各剂量组比5-Fu对照组的相对肿瘤增殖率稍低，但无显著性差异。结论：人外周血γδT细胞对肝癌裸鼠移植瘤具有显著的抑瘤作用,为建立肝癌免疫治疗新方法提供实验依据。

裸鼠；肝肿瘤模型；γδT细胞；免疫疗法

我国是肝癌高发国家，肝癌发病人数占全球的55%，多发生在肝炎或肝硬化的基础上，造成肝脏的储备及再生功能降低。肝癌治疗最好的方法仍是手术治疗，但由于临床所见肝癌多已进入中晚期，能够实施根治性切除术的肝癌只是少数。

为了寻找有效的肝癌治疗方法，我们研究用特异激发和扩增γδT细胞的方法，探讨γδT细胞对原发性肝癌的治疗作用，为肝癌的治疗提供一种有效的免疫治疗方法和手段。

目前，肿瘤的免疫治疗在恶性肿瘤的治疗中发挥着重要作用，而T淋巴细胞是免疫治疗肿瘤的主要细胞，T细胞可以依据其表面受体的不同表达而分为两类αβT细胞和γδT细胞。在抗肿瘤免疫中，由于γδT细胞对肿瘤抗原的识别不受MHC限制，而且不需要特异的抗原递呈作用，且对多种肿瘤细胞具有细胞毒活性。所以，本研究选择γδT细胞作为抗肝癌作用的效应细胞，通过体外特异性诱导培养，将不同剂量的γδT细胞作用于已建立的肝癌裸鼠模型，通过体内实验，研究其对人肝癌免疫治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 CO2培养箱，德国；Olympus显微镜，日本；SORVALL离心机，美国；BECKMAN流式细胞仪，美国；酶标仪RS-23EL，Switch。

1.1.2 试剂 IMDM、MTT Sigma公司；胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司；PE anti-human γ/δT Cell Receptor(B1):BioLegend公司；anti-human TCRγ/δ:Biolegend公司；InterluekinⅡ(IL-2):PeproTech公司；淋巴细胞分离液:中国科学院血液学研究所；5-氟尿嘧啶(5-Fu):250 mg/10 ml，天津金耀氨基酸有限公司生产，批号:1102241。

1.1.3 瘤株 人肝癌细胞瘤株SMMC-7721由吉林省肿瘤防治研究所提供。

1.1.4 实验动物 BALB/c雄性裸鼠50只,6～8周龄，体重20～25 g(中国医学科学院动物中心，合格证号：0232052)，饲养于SPF级无菌饲养室，自由摄取食物和水。

1.2 实验方法

1.2.1 γδT细胞的体外培养及鉴定 参考文献[1]。

1.2.2 SMMC-7721人肝癌荷瘤裸鼠模型的建立 将对数期的SMMC-7721细胞经0.25%-EDTA胰酶消化细胞重悬、计数后,调整细胞浓度制备5×106个/ml的细胞悬液。选健康活泼BALB/c雄性裸鼠50只，体重20～25 g，于每只裸鼠皮肤消毒后用 1 ml注射器于左侧大腿上方皮下接种细胞悬液0.1 ml，注射局部出现明显皮丘。接种第12天即可见直径为2～3 mm的肿瘤。以肿瘤生长至2～3 mm为成瘤标准，接种成瘤率100%。治疗前各组裸鼠饮食行为均表现正常。

1.2.3 裸鼠体内抑瘤实验

1.2.3.1 实验分组与给药 实验分组：根据所注射的γδT细胞数量分组，每组10只裸鼠。每一个试验组根据所注射的细胞数量，分为低剂量、中剂量及高剂量组。①生理盐水阴性对照组(A组)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常饮食外，尾静脉注射生理盐水。注射频率为第1～5天和第8～12天，注射生理盐水0.2 ml。②γδT细胞低剂量组(B组)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常饮食外，尾静脉注射γδT细胞1×105，注射频率同生理盐水注射相同，注射细胞液0.2 ml。③γδT细胞中剂量组(C组)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常饮食外，尾静脉注射γδT细胞5×105，注射频率同生理盐水注射相同，注射细胞液0.2 ml 。④γδT细胞高剂量组(D组)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常饮食外，尾静脉注射γδT细胞25×105，注射频率同生理盐水注射相同，注射细胞液0.2 ml 。⑤5-Fu阳性对照组(E组)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常饮食外，每日腹腔注射5-Fu 10 mg/kg，连续10 d。各组均自抑制成瘤试验第30天，脱颈处死裸鼠。

1.2.3.2 注射γδT细胞剂量的确定[2]是以60 kg的成人为基准，γδT细胞在临床预期使用剂量为1×109～1×1010个细胞(约1.6×107～1.6×108个细胞/kg)。把临床预期剂量中的最大剂量设定为注射剂量时，以裸鼠体重20 g为基准，其临床预期剂量相当于5×105～5×106个细胞/只。以临床预期剂量中的5×105个细胞/只作为中剂量，按5倍数量计算，设定了1×105、5×105及 25×105个细胞/只(0.2 ml)的注射剂量。

1.2.4 观察及评估项目

1.2.4.1 一般症状的观察 注射期间，观察一般状态的变化、运动性、外观等的一般症状，每周至少观察5次并掌握是否有死亡动物。

1.2.4.2 体重的测量 试验动物的体重，在分组及注射期间，每周测量5次。

1.2.4.3 肿瘤的体积 注射期间，每周5次使用测径器测量肿瘤的长轴及短轴，并计算测量的肿瘤体积，每次测量瘤径后计算肿瘤体积(mean tumor volume，TV)、相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)和相对肿瘤增殖率[T/C(%)]，计算公式如下：(1)TV(mm3)=AB2/2，其中A、B分别表示肿瘤的长和宽;(2)RTV=Vt/V0，其中V0为分组给药时(即d0)所测得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积；(3)T/C(%)=TRTV/CRTV×100%，其中TRTV为治疗组的RTV，CRTV为阴性对照组的RTV。疗效评价标准:T/C>60%为无效，T/C≤60%，并经统计学处理P<0.05为有效。

2 结果

2.1 一般症状 在注射试验物质的期间，除生理盐水组有1只裸鼠第12天死亡外，其余裸鼠没有发现特异的症状。

2.2 体重的测量 各组裸鼠在治疗期间体重均有不同程度的下降(表1)。裸鼠体重变化图见图1。由图1可知，除γδT(1×105)组下降比其余组略明显外，其余各组裸鼠体重变化趋势和程度基本一致。

2.3 瘤体积 裸鼠瘤体积生长情况见表2。肿瘤体积生长曲线见图2。由图2可知，各组裸鼠给药后前5 d肿瘤生长情况基本没有差别；在给药后第5天开始，5-Fu(10 mg/kg)组裸鼠与生理盐水对照组的裸鼠肿瘤体积增长趋势一致，曲线上升明显；注射不同浓度γδT细胞液的各组裸鼠的肿瘤体积增长趋势一致，曲线明显低于生理盐水组和5-Fu对照组。

2.4 RTV(相对肿瘤体积)值的测量 经测量裸鼠瘤体积与第1天给药时瘤体积，根据公式计算得到RTV值，结果见表3。由表3可知，与生理盐水阴性对照组相比，γδT细胞液各剂量组和5-Fu组均在第10至15天开始有显著差异，即肿瘤体积得到明显抑制，γδT细胞各剂量组抑制程度相似，均略高于5-Fu组。

2.5 相对肿瘤增殖率[T/C(%)] 经计算各实验组裸鼠相对肿瘤增殖率见表4。经SPSS统计分析结果可知，受试的γδT细胞液各剂量组与5-Fu阳性对照组的T/C(%)之间无显著差异。给裸鼠注射不同浓度γδT细胞液后的第10～15天，肿瘤生长抑制疗效显著。注射γδT细胞液的各剂量组比5-Fu阳性对照组的相对肿瘤增殖率稍低，但无显著性差异。

DaysoftreatmentAgroupBgroupCgroupDgroupEgroupd5-1.9±3.3-2.9±3.1-5.3±2.21)2)-1.9±3.9-2.0±1.6d10-4.0±6.0-7.9±2.51)2)-5.3±2.4-2.3±5.9-2.8±2.6d15-10.1±9.4-14.3±5.82)-10.4±4.5-10.8±6.0-8.6±4.4d19-14.9±30.4-11.5±7.7-6.9±6.5-6.7±7.7-7.5±6.6d25-12.8±32.0-7.8±10.0-1.3±5.7-2.1±9.40.7±7.2d29-15.5±31.1-7.5±9.8-4.8±4.5-3.1±9.2-2.9±8.2

Note：Compared with A group，1)P<0.05;compared with E group，2)P<0.05.

DaysoftreatmentAgroupBgroupCgroupDgroupEgroupd145.04±29.4459.93±47.3965.85±43.0053.46±35.2653.32±34.38d565.07±44.4960.20±22.1968.12±39.8358.95±42.4669.89±31.12d10118.00±107.3567.08±24.0773.83±37.2476.04±43.73110.25±71.86d15151.17±138.87 67.42±30.741)83.12±60.30 74.36±58.411)126.08±81.79d19171.53±133.07135.10±80.56151.24±109.39126.79±97.55189.75±102.77d25203.56±174.00154.51±112.65175.49±126.34168.79±174.71202.12±110.28d29282.77±268.08155.60±93.66165.97±121.67169.37±150.48246.94±141.87

Note：Compared with A group，1)P<0.05;compared with E group，2)P<0.05.

TimeAgroupBgroupCgroupDgroupEgroupd51.76±1.301.42±0.711.23±0.581.40±0.811.35±0.62d105.95±9.691.61±1.011)1.51±1.091)1.50±0.551)2.01±1.291)d158.12±13.741.59±1.121)1.36±0.571)1.63±1.041)2.20±1.061)d199.35±22.072.95±1.762.44±1.282.25±0.883.50±1.78d2510.43±25.003.23±2.052.94±1.482.54±1.483.70±1.79d2921.51±58.383.38±2.072.71±1.332.67±1.604.48±2.15

Note：Compared with A group，1)P<0.05;compared with E group，2)P<0.05.

图1 各实验组裸鼠体重变化Fig.1 Weight change of each experimental group nude mice

图2 各实验组裸鼠肿瘤体积生长变化图Fig.2 Tumor volume growth and change graph of each experimental group nude mice

图3 各实验组裸鼠瘤体大小Fig.3 Tumor size of each experimental group nude miceNote: 1.A group，tumor size 10 mm×9 mm;2.E group，tumor size 9 mm×9 mm;3.B group，tumor size 7.5 mm×7.5 mm;4.C group,tumor size 7.0 mm×7.0 mm;5.D group，tumor size 7.0 mm×6.8 mm.

表4 各实验组裸鼠相对肿瘤增殖率[T/C(%)]

Tab.4 Relative tumor proliferation rate of each experim-ental group[T/C(%)]

TimeafterinjectionBgroupCgroupDgroupEgroupd580.769.979.576.7d1027.11)25.41)25.21)33.81)d1519.61)16.71)20.11)27.11)d1931.626.124.137.4d2531.028.224.435.5d2915.712.612.420.8

Note:1) represents the treatment is effective.

3 讨论

细胞免疫治疗已经在多种肿瘤中显示出有效性[3-5]。γδT细胞是机体的一种免疫细胞，主要以非MHC限制方式识别抗原，可以分泌多种细胞因子诱发获得性免疫反应，被认为是联系机体固有免疫和适应性免疫的一种非传统T细胞，在机体的抗感染、抗肿瘤等方面发挥重要作用[6，7]。研究表明，γδT细胞对包括肝细胞癌、大肠癌、肺癌、前列腺癌在内的多种类型的肿瘤细胞都表现出较强的细胞毒性[8，9]。

康宁等[10]研究结果表明：体外扩增的γδT细胞在肿瘤组织中的分布取决于肿瘤局部CCR5和CXCR3配体分子的表达情况，高表达这些趋化因子的肿瘤可以作为γδT细胞过继免疫治疗的适应证。李华等[11]报道γδT细胞对宫颈癌细胞体外杀伤作用，发现体外培养的γδT细胞具有明显的杀伤宫颈癌细胞株SiHa和HeLa细胞的能力。

本实验通过不同剂量的γδT细胞，以5-Fu为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，研究其对裸鼠人肝癌细胞SMMC-7721移植瘤模型的免疫治疗作用。实验发现：静脉注射γδT细胞有明显肿瘤抑制作用，效果比5-Fu强。生理盐水阴性对照组有1只裸鼠死亡，5-Fu阳性对照组、γδT细胞的低剂量、中剂量及高剂量组无死亡动物。综上所述，人外周血γδT细胞对肝癌裸鼠移植瘤具有显著的抑瘤作用,为肝癌免疫治疗提供了一种新的治疗方法。

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[收稿2016-08-23 修回2016-10-13]

(编辑 张晓舟)

Immunotherapy experimental study of γδT cells from human peripheral blood on human liver cell nude mouse xenograft in vivo

XIALi,CHIYan-Fei,LIXiao-Feng,WANGJuan,LIUBai-Lin,HANGui-Hong,LIUYan-Hang,LIUYu-Xia.

People′sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China

Objective:To study the immunotherapy effects of different doses of human peripheral blood γδT cells on human hepatoma cells (SMMC-7721) xenograft model.Methods: (1)The nude mouse model of liver cancer was established by inoculated BALB/c mouse subcutaneous with human hepatoma cell line (SMMC-7721).(2)The mononuclear cells in healthy human were extracted from peripheral blood,and specific amplification γδT cells in vitro.(3) The nude mouse model divided into 5 groups by random.The positive control group was 5-Fu,negative control group was normal saline(NS).The treatment group was injected different doses of γδT cells(1×105,5×105and 25×105)by nude mice tail vein.The positive control group injected 5-Fu by enterocoelia,negative control group injected NS by tail veins.The inhibition effect of different dose γδT cells on tumor was observed,including weight，food intake and growth conditions,etc.and the changes of tumor volume (TV)，relative tumor volume (RTV)and relative tumor appreciation rate[T/C(%)] were compared with positive control group and negative control group.Results: Different dose of γδT cells had different degree of inhibition on nude mouse xenograft growth.RTV compared with saline negative control group was statistically significant (P<0.05).Compared with the positive control group of 5-Fu,the TV growth was significantly lower than the 5-Fu,degree of inhibition was similar in RTV each dose group,and all slightly higher than the 5-Fu positive control group.The each dose group of T/C (%)was slightly lower than the relative tumor proliferation rate of the control group of 5-Fu,but had no significant difference.Conclusion: The γδT cells from peripheral blood had significant inhibitory effect on nude mice transplanted liver tumor and it may be used as a new treatment for liver cancer immunotherapy provide experimental data.

Nude mice;Liver tumor model;γδT cell;Immunotherapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.014

①本文受吉林省科技发展计划项目(20160101197JC)资助。

夏 莉(1960年-)，女，医学硕士，科主任，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事肝癌、胃癌、肺癌等研究工作，E-mail：15843076550@139.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)05-0702-05

②通讯作者，E-mail：lyxia620126@163.com，吉林省肿瘤防治研究所，长春130012。