2型糖尿病人群中PSMD9基因多态性与血糖和高血压的相关性

目的分析蛋白酶调解因子9（PSMD9）基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个单核苷酸多态性（SNP）位点的多态性与2型糖尿病（T2DM）及T2DM合并高血压（HTN）之间的关系，探讨其作为国人T2DM合并高血压分子标记物的可能性。方法采用直接测序法检测研究对象PSMD9基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点的多态性，包括T2DM无高血压患者50例（T2DM组）、原发性高血压血糖正常患者50例（HTN组）、T2DM合并高血压患者100例（T2DM-HTN组）以及健康对照者50例（NC组），并测定血压、空腹血糖及糖化红蛋白。结果 PSMD9 IVS3 nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C和E197G A＞G 3个位点基因型均符合Hardy Weinberg平衡，表明本研究具有群体代表性。连锁不平衡检验结果显示这3个SNP位点之间存在连锁不平衡现象，其中IVS3 nt437和IVS3 nt460两个SNP位点完全连锁不平衡(D′=1.00,r2=1.00，P＜0.01)，E197G与IVS3 nt437和IVS3 nt460之间存在很强的连锁不平衡 (D′=0.96，r2=0.88，P＜0.01)。PSMD9基因IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点与血糖、高血压均无关，但PSMD9基因的A/T/G单倍型与血糖存在关联，而且与国人的T2DM合并高血压呈正相关。结论 PSMD9的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点多态性与T2DM患者的血糖及T2DM合并高血压的发病相关，因此，PSMD9可以作为T2DM合并高血压的一个候选基因来研究。

2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）合并高血压的患者无论是心脑血管事件或者肾功能损害等的发生率要明显比单一糖尿病患者的发生率高[1]。在高血压人群中，糖尿病发病风险增加，研究发现高血压是糖尿病发病的高危因素[1-2]。但T2DM合并高血压的病理生理机制尚不明确。目前已经发现有不同种族的多个基因与T2DM关联，位于12q24的蛋白酶调解因子9（proteasome modulator 9，PSMD9）在糖尿病发生中发挥了重要作用[3]。作为胰岛素基因转录共活化物，PSMD9在胰岛上高表达。有研究表明，PSMD9 3个单核苷酸多态性（SNP）位点与血压密切相关[4]。但对国人T2DM人群进行PSMD9基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点多态性的分析还未见报道。笔者拟对T2DM合并高血压患者进行PSMD9基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点进行基因分型研究，探讨PSMD9是否可作为T2DM合并高血压的遗传学基础和分子标记物，为个性化预防和治疗T2DM合并高血压提供理论基础。

1 对象和方法

1.1 对象选择本院2011年1月至2014年12月内分泌科及心血管科住院的高血压患者（HTN组）50例、T2DM患者（T2DM组）50例及T2DM合并原发性高血压患者（T2DM－HTN组）100例。HTN组男25例，女25例，年龄45～63（54.8±9.6）岁；T2DM组男26例，女24例，年龄43～65（55.5±10.5）岁；T2DM－HTN组男50例，女50例，年龄44～69（55.1±9.9）岁。纳入标准：（1）确诊T2DM或原发性高血压，T2DM诊断标准均参照世界卫生组织1999年糖尿病诊断标准，原发性高血压诊断均符合《中国高血压防治指南》的诊断标准[5]；（2）年龄18～75岁。排除甲状腺异常等其它内分泌疾病以及特殊类型糖尿病、继发性高血压患者。选取2012年3月至2013年8月我院健康体检中心的血压、血糖均正常体检人群50例作为正常对照组（NC组），男25例，女24例，年龄45～57（55.8+11.1）岁。排除标准：（1）排除糖尿病酮症及酮症酸中毒等急性并发症；（2）排除高血压危象；（3）急性感染；（4）严重心肾脑等靶器官损伤。所有研究对象均无血缘关系的中国汉族人，且各组人群性别、年龄等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经我院伦理委员会批准，全部调查和取样均征得受试者同意并签署知情同意书。

1.2.1 基本资料采集采集病史（现病史、既往史、T2DM及高血压家族史等），测量身高、体重、BMI、血压（收缩压、舒张压）。采用电子血压计测量所有受试者在安静状态下上臂的血压，取3次平均值。

1.2.2 实验室检查所有入选对象均在禁食8h后清晨抽取外周静脉血10ml，其中5ml静脉血分离血浆采用Olympus AU 5400全自动生化分析仪测定空腹血糖（FBG）等生化指标，采用美国伯乐糖化血红蛋白仪器检测糖化血红蛋白A1c（HbA1c）。另外5ml静脉血，置于EDTA抗凝管中，利用Qiagen Blood DNA mini kit（德国Qiagen公司）提取基因组DNA，测定浓度后于－80℃保存备用。

1.2.3 PSMD9基因多态性检测参考Gragnoli[4]利用直接测序法检测分析PSMD9基因多态性。具体步骤：（1）引物设计与合成：从NCBI的SNP数据库查找PSMD9的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点所在基因信息，在两端设计PCR引物，以供扩增和测序用。PSMD9的IVS3+nt460 A＞G和IVS3+ nt437 T＞C均位于PSMD9的第3个内含子（intron 3，IVS3），使用相同的引物（P1）扩增这两个SNP所在的基因组DNA。PSMD9的E197G A＞G位于PSMD9的第5个外显子，使用另一对引物（P2）扩增这个SNP所在的基因组DNA。P1上游引物:5′－ACAGAAGATGATAAATGTCCCAAG－3′，P1下游引物:5′－TGCATGGCTCTGTGAATACACCG－3′；P2上游引物:5′－CAATTGTGTACTA－TGTACCTTG－3′，P2下游引物：5′－ACTGGAGAGACTCCCAGGAGAG－3′。所用引物均由杭州欣耕生物科技有限公司合成。（2）DNA抽提：取5ml血样并加入抗凝剂EDTA，用Qiagen Blood DNA mini kit提取外周血基因组DNA。（3）PCR扩增及其产物测序：以100ng人样本的基因组DNA为模板，50μl PCR反应液为PCR扩增体系，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测扩增结果，紫外线光下观察结果、拍照，割胶回收后，进行测序，然后与正常序列对比，得到每个样本的基因多态性位点差异。样本送杭州迅捷生物技术有限公司测序。（4）基因型频率的计算：根据直接测序法获得每例测试者的PSMD9基因SNP基因型，通过直接计数的方法获得对照组，实验组的基因型频率。

1.3 统计学处理应用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析；各组间基因型分布和等位基因频率比较采用χ2检验。采用Hardy Weinberg平衡检验分析基因型频率是否保持平衡。应用Haploview4.0软件分析SNP间的连锁不平衡，采用连锁不平衡系数D′和r2表示连锁不平衡的程度，并计算PSMD9基因3个多态位点的单倍型频率。基因型－表型之间，单倍型与T2DM、高血压及T2DM合并高血压的相关性分析采用Spearman相关。采用优势比（OR）值衡量两变量之间的相关程度。

2 结果

2.1 4组一般资料的比较各组间BMI比较无统计学意义（P＞0.05）。HTN组与T2DM－HTN组收缩压与舒张压均高于T2DM组、NC组，组间有统计学差异（P＜ 0.05）；T2DM组与NC组患者血压水平比较无统计学差异（P＞0.05）。T2DM－HTN组、T2DM组FBG、HbA1c均较HTN组、NC组明显升高，差异均有统计学差异（均P＜0.05）；T2DM－HTN组与T2DM组FBG、HbA1c比较均无统计学差异（均P＞0.05），详见表1。

2.2 PSMD9基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点的检测及基因型等位基因的分布比较 PSMD9的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+ nt437 T＞C及E197G A＞G位点目标基因片段长度均为580 bp（图1），然后送生物公司进行直接测序。根据直接测序法获得每个测试者PSMD9基因的SNP，通过直接计数的方法获得4组基因型频率（表2～4）。采用Hardy Weinberg平衡检验分析PSMD9 IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C和E197G A＞G 3个多态性位点，结果显示P值分别为0.18、0.18及0.16，表明3个位点各基因型和等位基因频率分布处于遗传平衡，具有群体代表性。T2DM－HTN组、T2DM组、HTN组PSMD9基因IVS3+nt460 SNPs的A、G等位基因的频率、A/A、A/G、G/G基因型的频率与NC组相比均无统计学差异；T2DM－HTN组、T2DM组、HTN组PSMD9基因IVS3+nt437SNPs的T、C等位基因的频率、T/T、C/T、C/C基因型的频率与NC组相比均无统计学差异；T2DM－HTN组、T2DM组、HTN组 PSMD9基因E197GSNPs的A、G等位基因的频率、A/A、A/G、G/G基因型与NC组相比亦无统计学差异。

2.3 PSMD9基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点连锁水平的分析 PSMD9基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点在同一条染色体内且相邻。对这3个 SNP位点进行连锁不平衡分析发现，IVS3 nt437和IVS3 nt460两个SNP位点完全连锁不平衡（D′=1.00，r2=1.00，P＜0.01），E197G与IVS3 nt437和IVS3 nt460之间存在很强的连锁不平衡（D′=0.96，r2=0.88，P＜0.01）。这表明PSMD9的这3个SNP位点在T2DM相关疾病中共同发挥作用。

图1 PSMD9基因IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C和E197G A＞G 3个位点的基因组DNA产物电泳图（1：2 000 DNA marker；2：无引物；3：P1上下游引物，没加基因组DNA模板；4：P2上下游引物，没加基因组DNA模板；5：P1上下游引物扩增得到的DNA产物；6：P2上下游引物扩增得到的DNA产物）

2.4 PSMD9基因多态性与T2DM、高血压的相关性通过对PSMD9基因IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G位点多态性分析，T2DM－HTN组、T2DM组、HTN组与NC组之间均无统计学差异（均P＞0.05）,显示PSMD9基因IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点与血糖及血压均无关联，详见表5。

2.5 PSMD9基因A/T/G与T2DM、高血压的相关性通过对PSMD9基因的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP基因型频率进行计算。单倍型G/C/G的基因型频率为0.2451，单倍型G/C/A的基因型频率为0.4444，单倍型A/T/G的基因型频率为0.2582。结果表明主要存在3个主要单倍型（频率均＞5%），见表6。PSMD9基因的IVS3+nt460和IVS3+nt437组成一个单倍域。基因型-单倍型分析结果显示PSMD9基因的A/T/G单倍型与血糖存在关联，而且与我国的T2DM合并高血压呈正相关，见表7，其余2个单倍型与血糖和我国的T2DM合并高血压无相关性（P＞0.05）。因此，PSMD9可以作为T2DM合并高血压的一个候选基因来研究。

3 讨论

T2DM是一种复杂的多基因疾病，病因和发病机制复杂，病因至今尚未完全阐明。在诸多危险因素中遗传因素的作用最为突出。T2DM的遗传模式主要分两种：（1）单基因模式，即由单个疾病基因引起，目前发现导致T2DM的单基因致病基因很少，如青少年发病的成人型T2DM（MODY）[6]；（2）多基因模式，绝大多数T2DM为多基因遗传病[7-9]。已确定与T2DM连锁的染色体区域有：2q37.3（命名为NIDDM1区域）、12q24.2（命名为NIDDM2区域）、20q12-q13.1（命名为NIDDM3区域）、1q21-24、3q27-qter、9号染色体、12q15和18p11等。其中，在NIDDM1区域内克隆了CAPN10基因，在NIDDM3区域内发现了 GLUT10基因，均引起了广泛的关注[6,10]。Mahtan等[11]报道芬兰人T2DM与12q24.2连锁（命名为NIDDM2），至今NIDDM2区域内尚没有突破性的发现。MODY3致病基因肝细胞核转移因子1基因（Hepatic nuclear factor 1，HNF-1）恰好位于NIDDM2区域内[13-15]。MODY3/肝细胞核因子-1α（HNF-1α）为调节胰岛素基因表达的转录因子变异。但大量的遗传关联分析证实HNF-1的任何一个突变与T2DM均不存在关联，因而有必要在此区域内寻找其它关联基因。PSMD9基因位于染色体12q24位点。Gragnoli等[15]发现PSMD9基因与MODY3连锁。

PSMD9生物学作用非常广泛。PSMD9过度表达导致β细胞的功能障碍，促进T2DM的发生。但是PSMD9单位点的基因突变很少导致T2DM的发生[14]。本研究发现 PSMD9的 IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点之间存在连锁不平衡现象。这表明PSMD9的这3个SNP位点在T2DM相关疾病中共同发挥作用。这与Gragnoli等[15]的报道一致。PSMD9基因A/T/G单倍型与迟发糖尿病及MODY3发病有关[12]。PSMD9的SNP与糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变、腕管综合征、高胆固醇血症及糖尿病大血管病变有关[14-19]。

PSMD9与T2DM合并高血压有关联，其染色体12q24位点与视网膜血管管径的变化相关[10]。视网膜血管变化及微循环异常对于预测早期微血管病变及心血管事件非常重要。两个独立样本研究结果显示，染色体12q24位点与冠心病和高血压存在相关性[6]。Gragnoli等[4，14]证实PSMD9的IVS3+nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP与血压密切相关。但是这些研究结果尚未在其他种族中确认，这些PSMD基因突变可能存在种族和群体特异性。本研究表明，在我国汉族的T2DM患者中PSMD9基因的A/T/G单倍型与血压密切相关。因此，PSMD9可以作为T2DM合并高血压的一个候选基因来研究。

目前，我国已成为一个糖尿病与高血压高发的国家。据不完全统计我国的糖尿病患者9 400万，高血压患者已超过2亿人，每年还在继续新增糖尿病和（或）高血压患者。众所周知，糖尿病合并高血压的患者无论是心脑血管事件或者肾功能损害等的发生率要明显高于糖尿病单病患者。一旦患者发生心脑肾等并发症，不仅生活质量明显下降，而且对个人、家庭及社会产生沉重的负担。人们希望可以通过个性化干预治疗护理等方法降低T2DM合并高血压的比例及医疗费用。本研究显示与T2DM合并高血压有关联的PSMD9基因的IVS3+ nt460 A＞G、IVS3+nt437 T＞C、E197G A＞G 3个SNP位点可以用于我国T2DM合并高血压的分子标记物，为T2DM患者提供其患高血压的风险预测；也有可能成为无合并高血压或者合并高血压前期的T2DM患者提供个性化护理与医疗指导的分子依据。

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PSMD9 gene polymorphism is associated with plasma glucose and hypertension in type 2 diabetic patients

SONG Yingxiang,HUA Yanyin,ZHANG Yulyu,et al.Department of Endocrinology,Zhejiang Provincial People′s Hospital,affiliated to Hangzhou Medical College,Hangzhou 310014,China

310014 杭州，浙江省人民医院/杭州医学院附属人民医院内分泌科

【 Abstract】 Objective To investigate the association between the single nucleotide polymorphisms (SNPs)of Proteasome-Modulator 9(PSMD9)gene and the prevalence of type 2 diabetes or type 2 diabetes with hypertension in Chinese population.Methods PSMD9 gene rs74421874（IVS3+nt460 A＞G）,rs3825172(IVS3+nt437 T＞C)and rs14259(E197G A＞G) SNPs were determined by polymerase chain reaction(PCR)in patients with type 2 diabetes(T2DM,n=50),primary hypertension (HTN,n=50),type 2 diabetes with hypertension(T2DM-HTN,n=100)and normal controls(NC,n=50).The clinical data and lab parameters were collected.Results The three genotypes of PSMD9 IVS3 nt460 A＞G,IVS3+nt437 T＞C and E197GA＞G were all consistent with the Hardy Weinberg equilibrium(P＞0.05).Linkage disequilibrium(LD)was done between among three SNPs (P＞0.05).A complete linkage disequilibrium was found between IVS3 nt437 and IVS3 nt460(D′=1.00,r=1.00,P＜0.01).A strong linkage disequilibrium was found in E197G and VS3 nt437,IVS3 nt460(D′=0.96,r=0.88,P＜0.01).These three SNPs of PSMD9 gene IVS3+nt460 A＞G,IVS3+nt437 T＞C,E197G A＞G were not associated with blood glucose and hypertension.However, the A/T/G haplotype of PSMD9 gene was associated with blood glucose,type2 diabetes and hypertension. Conclusion The polymorphism of PSDM9 SNPs(IVS3+nt460 A＞G,IVS3+nt437 T＞C and E197G A＞G)is correlated with plasma glucose in type 2 diabetes and onset of type 2 diabetes with hypertension,indicating that PSMD9 might be a candidate gene for type 2 diabetes mellitus and hypertension.