艾塞那肽对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用*

黄琼珠， 刘潇萌， 黄国全， 王丽娟， 郑玉洁， 陈鑫城， 刘礼斌， 陈 洲△

(1. 福建医科大学药学院, 福州 350122； 2. 福建医科大学附属协和医院内分泌科 福建内分泌研究所, 福州 350001；3. 中国人民解放军第四七六医院内分泌科, 福州 350002)

艾塞那肽对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用*

黄琼珠3， 刘潇萌1， 黄国全1， 王丽娟1， 郑玉洁1， 陈鑫城1， 刘礼斌2， 陈 洲1△

(1. 福建医科大学药学院, 福州 350122； 2. 福建医科大学附属协和医院内分泌科 福建内分泌研究所, 福州 350001；3. 中国人民解放军第四七六医院内分泌科, 福州 350002)

目的：探讨GLP-1类似物艾塞那肽(exenatide)对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法：SD大鼠随机分为正常组(NC组，n=8)和模型组；模型组给予高脂高糖饲料，喂养4周后腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)建模，72 h后以血糖≥16.7 mmol·L-1为糖尿病成模标准，将成模大鼠随机分为糖尿病对照组(DM组，n=10)、3 μg·kg-1艾塞那肽干预(Ex-1)组和6 μg·kg-1艾塞那肽干预(Ex-2)组；艾塞那肽组连续皮下注射艾塞那肽(bid)12周，NC组和DM组注射等容积溶剂；测定各组大鼠糖脂代谢变化和肾功能指标如血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)、尿素氮(BUN)、24 h尿微量白蛋白排出率(24 h UMA)并计算肌酐清除率(Ccr)；测定肾组织氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛( MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)；HE染色观察肾组织病理形态及ELISA法测定肾组织糖基化终末产物AGEs水平。结果：与糖尿病组相比，艾塞那肽可明显改善糖尿病大鼠糖脂代谢，血糖、糖基化血红蛋白(HbAlc)、甘油三脂及胆固醇值均下降(P<0.05)，肾功能指标明显好转(P<0.05)且肌酐清除率下降(P<0.05)，提示肾小球高滤过状态；同时改善糖尿病引起的肾组织病理结构改变，AGEs浓度下降(P<0.05)，氧化应激指标SOD和GSH-Px活力升高，MDA含量降低(P<0.05)。结论：艾塞那肽具有肾脏保护作用，其机制可能与抑制糖尿病大鼠肾组织的AGEs生成和改善氧化应激有关。

艾塞那肽；糖尿病肾病；糖基化终末产物；氧化应激

【DOI】 10.12047/j.cjap.5466.2017.033

糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症，也是终末期肾病和糖尿病死亡的重要原因[1]。其发病机理复杂，目前认为与肾血管动力学改变、氧化应激、炎症反应、糖代谢紊乱等多项因素相关[2]，而且这些因素之间常常会相互促进，共同推动糖尿病肾病进程。越来越多研究指出，AGEs-RAGE-氧化应激系统在糖尿病及糖尿病肾病的发生发展中起着重要的作用，糖尿病患者和糖尿病大鼠、小鼠肾组织中AGEs、RAGE水平显著高于正常对照组，而且与糖尿病肾病具有相关性。增多的AGEs可与内皮细胞、系膜细胞等细胞表面上的RAGE受体结合，启动细胞信号转导，诱导氧化应激、促进一系列炎症反应，导致DM组大鼠肾组织纤维化相关指标表达增加，从而引起或加重糖尿病肾病的进程[3]。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种具有促胰岛素分泌作用的胃肠类激素，也是近年来糖尿病药物研究的热点[4]。艾塞那肽(Exenatide, Ex)是首个人工合成的GLP-1类似物，研究发现其除了降低血糖，还有抗氧化应激、抑制细胞凋亡等多效性[5]，国外临床研究亦提示其对糖尿病患者有肾脏保护作用[6]，但具体机制有待进一步研究。本实验拟观察艾塞那肽对实验性糖尿病大鼠肾脏的保护作用，并从糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)和氧化应激方面探讨其保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ, Sigma, USA)；艾塞那肽注射剂(Baxter Pharmaceutical Solution LLC)；大鼠糖基化血红蛋白(HbA1c)试剂盒(上海西塘生物科技有限公司)；大鼠AGEs试剂盒(Uscn Life Science，USA)；丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(南京建成生物技术有限公司)

1.2 实验动物及饲养

雄性SD大鼠，体重200 ±30 g，购自福建医科大学实验动物中心，饲养于SPF屏障系统，12 h昼/夜周期。实验全过程符合《实验动物管理条例》。

1.3 模型建立及分组

大鼠随机分为正常组(NC组，n=8)和模型组。模型组给予高脂高糖饲料，喂养4周后腹腔注射STZ(30 mg·kg-1，柠檬酸缓冲液稀释)建模，72 h后测血糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1为糖尿病成模标准[7]。将成模大鼠随机分为糖尿病对照组(DM组，n=10)、3 μg·kg-1艾塞那肽干预(Ex-1，n=8)组和6 μg·kg-1艾塞那肽干预(Ex-2，n=8)组。艾塞那肽连续皮下注射(bid)12周，NC组和DM组注射等容积溶剂。

1.4 样本制备

实验结束前2 d，将大鼠放入代谢笼(1只/笼)，禁食不禁水，记24 h尿量，免疫比浊法测定尿微量白蛋白浓度，计算24 h尿微量白蛋白排泄率(24 hour urine micro-albumin，24 h UMA)。末次给药后禁食12 h，大鼠称重、测空腹血糖，给予10%水合氯醛(0.03 ml·kg-1)腹腔注射麻醉固定，经腹主动脉采血8 ml备用；快速取出左右肾，分离肾被膜并称重记录，计算肾指数[(肾重mg/体重g)×1 000]；右肾存于-80℃备用；左肾固定、脱水、石蜡包埋和切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察病理变化。

1.5 生化指标检测

糖基化血红蛋白HbA1c(glycated hemoglobin A1c)采用ELISA检测，血清总胆固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿肌酐(urine creatinine, Ucr)、尿素氮(blood urea-nitrogen，BUN)等采用Beckman全自动生化分析仪测定，计算肌酐清除率(creatinine clearance rate,Ccr)[8]。

1.6 肾组织AGEs和氧化应激指标检测

冻存的肾组织制成10%肾组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液分装备用，按照试剂盒说明分别采用ELISA法测AGEs，TBA法测定MDA，WST-1法测定SOD，比色法测定GSH-Px。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 艾塞那肽改善糖尿病大鼠一般情况

与NC组大鼠相比，DM大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿，且毛发色泽暗淡、精神萎靡、活动减少，体重增长缓慢。Ex干预组大鼠一般状态好转，摄食、进水量较DM组显著下降。

2.2 艾塞那肽改善糖尿病大鼠糖脂代谢指标

结果显示DM组血糖、HbA1c、TG及CHOL与NC组相比均明显升高(P<0.05)，Ex干预组相关指标均下降(P<0.05)，糖脂代谢改善(表1)，但Ex-1与Ex-2之间统计学比较无显著差异。

2.3 艾塞那肽改善糖尿病大鼠肾脏损伤

2.3.1 艾塞那肽对糖尿病大鼠肾功能指标的影响 表2可见，DM组大鼠肾指数和24 h UMA明显高于NC组大鼠(P<0.01)，肌酐清除率Ccr高于NC组(P<0.05)，提示糖尿病状态下肾脏高滤过；Ex干预组大鼠肾指数和24 h UMA则较DM组大鼠下降(P<0.05)；且Ccr下降(P<0.05)，显示高滤过状态改善，但两组Ex组之间比较无显著性差异。

2.3.2 艾塞那肽对肾组织形态结构的影响 HE染色普通光学显微镜下观察可见，与NC组大鼠相比，DM组大鼠部分肾小球增生，肾小管细胞肥大、排列紊乱，管腔内偶见渗出物，肾间质偶见炎性细胞浸润，肾内小动脉壁增厚，管腔狭窄，管周纤维化，Ex干预组则上述病理改变明显减轻(图1见彩图页Ⅰ)。

2.3.3 艾塞那肽对糖尿病大鼠肾组织AGEs和氧化应激指标的影响 与NC组相比，DM组肾组织AGEs浓度明显增加(P<0.01，表3)；肾组织呈氧化应激状态，SOD和GSH-Px活力明显降低而MDA增加(P<0.05)；与DM组相比，Ex干预组AGEs浓度下降(P<0.05)；而且氧化应激指标SOD和GSH-Px活力升高，MDA含量降低(P<0.05)，但两组Ex组之间无显著性差异。

Tab. 1 Effects of exenatide on metabolic characteristics of rats ±s)

GLU: Glucose; HbA1c: Glycated hemoglobin A1c; TG: Triglyceride; CHOL: Cholesterol; NC: Control; DM: Diabetes mellitus group; Ex: Exenatide

*P<0.05vsNC group；?#P<0.05vsDM group

Tab. 2 Effects of exenatide on the function of kidney of ±s)

BUN: Blood urea-nitrogen; Ccr: Creatinine clearance rate; 24 h UMA: 24 hoururine micro-albumin

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;?#P<0.05vsDM group

Tab. 3 The level of AGEs and the characters of oxidative stress of renal ±s)

AGEs: Advanced glycation end products; GSH-Px: Glutathione peroxidase

*P<0.05,**P<0.01vsNC group；?#P<0.05,##P<0.01vsDM group

3 讨论

GLP-1是机体血糖稳态的重要肠道调节激素之一，它一方面可增强葡萄糖依赖的胰岛素分泌反应，另一方面通过作用于中枢神经系统促进饱胀感，减少食物摄入，从而减轻胰岛β细胞负担，降低体重，是目前降糖药研究的热点之一。GLP-1类似物艾塞那肽，可结合并激活GLP-1受体，其作用与内源性GLP-1相似。本实验结果显示艾塞那肽干预除了改善糖尿病大鼠一般状况之外，还可降低血糖血脂，艾塞那肽组大鼠空腹血糖、HbA1c以及TG、CHOL均比DM组降低，这与国外报道一致[8,9]；同时肾功能检测中发现，干预组肾指数和24 h UMA也较DM组大鼠降低，肌酐清除率较DM组下降，肾脏高滤过状态改善，同时艾塞那肽干预组大鼠肾脏肾小球肥大和肾组织病理形态改变也有所缓解，证实艾塞那肽除了降糖作用之外，对糖尿病大鼠肾脏损伤也具有改善作用。但是实验中通过结果统计分析发现，两个不同剂量的艾塞那肽干预组之间多方面指标差别并无统计学意义，提示这一剂量范围内艾塞那肽对糖尿病肾脏功能指标的改善没有明显的量效关系。

近年来越来越多的国内外研究显示，GLP-1类似物改善糖尿病肾病中肾脏损伤的作用，可能还具有降糖之外的其他机制，如Hiroki[10]等的研究提示GLP-1类似物可能通过激活cAMP-PKA信号通路，影响NAD(P)H 氧化酶可能是其改善糖尿病肾病的机制之一。同时，大量研究结果也证实，AGEs和氧化应激在糖尿病肾病发展中起着重要的作用[7]。AGEs是指蛋白质、脂质或核酸等大分子在没有酶参与的条件下，自发的与葡萄糖或其他还原单糖反应所生成的产物。AGEs 能够结合并破坏组织细胞，从而加速衰老及多种疾病的进展。机体高糖状态导致AGEs生成并在肾组织蓄积，使肾间质纤维化和肾组织损伤。本实验中DM大鼠肾组织AGEs浓度明显高于NC组(P<0.01)，提示非酶促糖基化作用在DM模型大鼠肾脏损伤中起一定的作用。高糖引起氧化应激，增多的AGEs也诱导氧化应激促进氧自由基大量产生，加重肾损伤，而氧化应激又会加速AGEs的生成，二者共同促进糖尿病肾病的发生发展[11,12]。如实验所示，DM组大鼠体内氧化和抗氧化能力失衡，肾组织MDA含量升高，MDA是常见的脂质过氧化产物，可间接反映细胞受损程度；而SOD和GSH-Px的活力明显低于NC组，SOD反映机体清除自由基的能力，GSH-Px则是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害，因此DM组为氧化应激状态。艾塞那肽干预组肾功能改善，同时肾组织AGEs含量降低，SOD和GSH-Px的活力提高，MDA含量减少，提示除了改善糖脂代谢外，抑制非酶促糖基化作用、改善氧化应激可能也是艾塞那肽发挥肾脏保护作用的重要机制。

上述结果表明，艾塞那肽具有延缓DM及肾脏损伤进程的作用，可能与其影响AGEs-RAGE-氧化应激系统有关，可为该类药物在糖尿病肾病治疗的临床应用提供新思路。

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The protective effect of exenatide on the renal injury in diabetic rats

HUANG Qiong-zhu3, LIU Xiao-meng1, HUANG Guo-quan1, WANG Li-juan1, ZHENG Yu-jie1, CHEN Xin-cheng1,LIU Li-bin2, CHEN Zhou1△

(1. College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350122; 2. Fujian Institute of Endocrinology, Department of Endocrinology, Union Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001; 3. Department of Endocrinology, the 476th Hospital of People's Liberation Army, Fuzhou 350002, China)

Objective: To investigate the protective effect of exenatide (Ex) on the renal injury in streptozotocin-induced diabetic rats． Methods: Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups: normal control group (NC group,n=8) and model group. Model group was injected with low dose of streptozotocin (30 mg·kg-1) after the rats were fed with high fat and high glucose diet for 4 weeks. Seventy-two hours later, rats of blood glucose level ≥16.7 mmol·L-1were divided into diabetes mellitus group (DM,n=10) and two exenatide-treated groups (Ex groups，3 or 6 μg·kg-1,n=8). Ex groups subcutaneously injected with exenatide for 12 weeks, but NC group and DM group were injected with the same volume of solvent. Changes in glycolipid metabolism and renal function such as serum creatinine (Scr), urine creatinine (Ucr), blood urea nitrogen (BUN), 24 hour urine micro-albumin (24 h UMA)in the 4 groups of rats were determined and creatinine clearance rate (Ccr) were calculated. Renal oxidative stress parameters such as superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde(MDA), glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to examine pathological morphology in the renal tissues and ELISA was performed to determine the level of advanced glycation end products(AGEs), the glycosylation end product in renal tissues. Results: Compared to the DM group，glycolipid metabolic abnormalities in the exenatide-treated groups were significantly ameliorated with lower levels of blood glucose，HbAlc, cholesterol and triglyceride (P<0.05). The renal function index was markedly improved (P<0.05) with Ccr reduced, indicating a high glomerular filtration status. Meanwhile, exenatide treatment improved the diabetes-induced pathological changes in renal morphology, substantially increased the activities of SOD and GSH-Px, and reduced the levels of MDA and AGEs. Conclusion: Exenatide has the renal protective effect probably by the mechanisms of inhibition of AGEs production and reduction of oxidative stress in the renal tissues of diabetic rats.

exenatide； diabetes nephropathy； advanced glycation end products； oxidative stress

福建省科技厅重点项目(2013Y0041)福建省财政厅专项资助(2012B022)；国家卫计委共建科学基金-福建省卫生教育联合攻关计划(wkj-fj-12)

2016-06-20

2016-12-14

R587.1

A

1000-6834(2017)02-128-04

△【通讯作者】Tel: 13960833981； E-mail: kellandchen1007@Hotmail.com